高壓液相色譜儀測定HbA2 HbF的影響因素分析

張奇 沈陽市鐵西區(qū)衛(wèi)生健康服務(wù)與行政執(zhí)法中心（沈陽市鐵西區(qū)疾病預(yù)防控制中心） （遼寧 沈陽 110021）

內(nèi)容提要： 目的：探究高效液相色譜儀測定HbA2/HbF的影響因素的定性定量指標(biāo)。方法：選取40例血紅蛋白病檢測樣本。根據(jù)采集順序的不同，將其分為1、2兩個(gè)組進(jìn)行有效研究。測定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并結(jié)合實(shí)際情況，分析洗脫時(shí)間，峰形的測值的影響因素。使用D-10 Dual Program儀器的地中海地貧模式，采用高效液相色譜儀測定（HPLC）方式檢測。一組使用直接上樣的方式，另外一組使用的是血紅蛋白液上樣。結(jié)果：樣本條件的影響，一部分全血使用的是全血上樣的模式1:300的比例稀釋，一部分是以1:200比例稀釋樣血紅蛋白液的模式進(jìn)行上樣，進(jìn)行分析。檢驗(yàn)證明，1:200的比例的血紅蛋白上樣中，上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本。以上檢驗(yàn)需要控制面積需要保持在100000～4000000μvolt.范圍內(nèi)，避免堵塞情況呈現(xiàn)。并且峰值過飽和情況的檢測是不精確的，需用堿變性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，或者需倍比稀釋或梯度稀釋樣本再行測定。異常血紅蛋白病的峰形圖會有特征性變化，比如：時(shí)間處于0.37min的時(shí)候，unknown的數(shù)值，血紅蛋白S-Window值等就會呈現(xiàn)。兩組資料的基本情況無明顯差異（P＜0.05）。結(jié)論：樣本稀釋度的大小，直接影響了地中海貧血模式橫掃面積，并影響了HbA2/HbF的測定值。峰值過飽和的情況下，需用堿變性法進(jìn)行驗(yàn)證。并且對異常血紅蛋白病峰形的觀察，可以對地貧基因的探究起到一個(gè)較好的提示性作用。

近年來，高效液相色譜儀測定（HPLC）技術(shù)不斷進(jìn)步，其中，HbA2定量分析是目前被廣泛認(rèn)可的檢測技術(shù)。本文按照HbA2/HbF的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行探究，主要分析HPLC檢測中容易被忽視的影響因素[1]。探究全血中HbA2/HbF的百分量，使用在D-10Dual Program 儀器地中海貧血模式，利用高效液相色譜儀測定，對上樣樣本制備，觀察分析洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形，影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素，進(jìn)而進(jìn)行有效對比分析[2]。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

選取40例血紅蛋白病檢測樣本。根據(jù)采集順序的不同，將其分為1、2兩個(gè)組進(jìn)行有效研究。測定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并結(jié)合實(shí)際情況，分析洗脫時(shí)間，峰形的測值的影響因素。使用D-10 Dual Program儀器的地中海地貧模式，采用HPLC方式檢測。一組，使用直接上樣的方式，另外一組使用的是血紅蛋白液上樣。兩組資料的基本情況無明顯差異（P＜0.05），本次研究具有可比性。

1.2 方法

此次樣本人員在探究的樣本構(gòu)建之前，需要進(jìn)行樣本前的處理。1組直接上樣，2組血紅蛋白液上樣。其中，血紅蛋白的制備過程，主要以生理鹽水清洗方式3次，然后取壓積紅細(xì)胞，接著按照比例加入等量的雙蒸水，搖勻。再加上1/2的四氯化碳，在混合震蕩的情況下保持1min，靜止10min[3]。這個(gè)時(shí)候的離心率2000r/min，需要保持15min以上，接著吸取上清液，就可以提取到大約10%左右的血紅蛋白液。樣本處理好了之后，就需要進(jìn)行HbA2/HbF定量測定[4]。接著利用HPLC的方式，一個(gè)部分是1:200的比例，血紅蛋白上樣，一個(gè)部分是1:300的比例，直接上樣，按照參照對比的方式，分析HbA2/HbF的數(shù)值，進(jìn)行平行分析。這個(gè)時(shí)候就可以根據(jù)實(shí)際情況，探究洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形，對影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素進(jìn)行有效對比分析[5]。

1.3 觀察指標(biāo)

探究高效液相色譜儀直接上樣與血紅蛋白液上樣中，洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形，影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素進(jìn)行有效對比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件對研究得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，得到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用±s來進(jìn)行表示，用t來對計(jì)量資料檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)則通過χ2，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。

2.結(jié)果

1組與2組樣本直接上樣與血紅蛋白液上樣HPLC法檢測結(jié)果對比中1組有9例患者結(jié)果峰面積高于或者低于在100000～4000000μvolt.范圍內(nèi)。然而，2組上樣的結(jié)果峰面積全部控制在100000～4000000μvolt.范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)化的要求。因此，對樣本條件的影響，35例中是1:200的比例，一個(gè)部分是1:300的比例，接著使用直接上樣和血紅蛋白上樣的形式，進(jìn)行分析。檢驗(yàn)證明，1:200的比例的全血樣本中，上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本，見表1。

表1.1組與2組樣本直接上樣與血紅蛋白液上樣HPLC法檢測結(jié)果對比(n)

3.討論

針對于隨機(jī)40例的全血樣本取樣中，按照時(shí)間的順序，分為1、2兩組，1組直接上樣，2組血紅蛋白液上樣。首先，樣本條件的影響中，分別使用是1:200的比例和1:300的比例進(jìn)行上樣，換句話說就是使用血紅蛋白上樣和直接上樣的形式，進(jìn)行分析，控制面積需要保持在100000～4000000μvolt.范圍內(nèi)，避免堵塞情況呈現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1:300的比例的全血樣本，由于年齡的不同，很容易出現(xiàn)堵塞吸樣孔及標(biāo)本的情況出現(xiàn)，這樣就不符合上樣的峰面積需求。1:200的比例的血紅蛋白液上樣，就符合上樣的峰面積要求。這樣就可以更好、更全面地診斷血紅蛋白病。檢驗(yàn)證明，1:200的比例的血紅蛋白上樣中，上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本。其中有3例測量不出HbF值，需要在堿性的控制范圍上進(jìn)行測定。經(jīng)過以上1組與2組的實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)前處理的血紅蛋白液上樣的樣本，比直接上樣的精確率更高。并且峰值過飽和事后的檢測是不精確的，需用堿變性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證或者，需倍比稀釋或梯度稀釋樣本再行測定。由此，HPLC在檢測HbA2/HbF的定量指標(biāo)時(shí)的干擾因素的時(shí)候，需要根據(jù)樣本的稀釋度，樣本的年齡大小，峰形的圖形等進(jìn)行有效的分析，這樣才能提升基因分析，保證確診率，實(shí)現(xiàn)有效驗(yàn)證。