山蔞單芽莖段培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究

李新等

摘 要 以山蔞單芽莖段為外植體，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)和快速繁殖研究。結(jié)果表明：山蔞嫩莖最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒9 min；適合腋芽萌發(fā)的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；繼代增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；試管苗在1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根較好；山蔞試管苗移栽成活率可以達(dá)到95%以上。

關(guān)鍵詞 山蔞；組織培養(yǎng)；快速繁殖；表面消毒

中圖分類(lèi)號(hào) TS971 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Tissue culture and rapid propagation of Piper sarmentosum were conducted with single-node stems as the explants. The results showed that the best surface sterilization was achieved by immersing the explants in the solution of 70% alcohol for 30 seconds then in 0.1% HgCl2 solution for 9 minutes. The medium（MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）was suitable for starting culture of P. sarmentosum. Successful shoot proliferation was obtained on MS supplemented with 0.1 mg/L NAA and 3 mg/L 6-BA. The optimal rooting medium was 1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA.

Key words Piper Sarmentosum； Tissue culture； Rapid propagation； Surface sterilization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.026

山蔞（P. sarmentosum Roxb.）別名有山撈、假蒟、假蔞等，為胡椒科胡椒屬植物。在中國(guó)海南、廣東、廣西、云南、福建等南部省區(qū)均有分布。山蔞葉面光亮有革質(zhì)，有一種特異的香味。在海南黎族地區(qū)，人們常常用它的葉子來(lái)做菜，極具地方風(fēng)味特色，著名的菜品有“黎家綠葉寶”、“山蔞葉肉碎煎蛋角”、“山蔞葉煎蛋”、“假蔞煎肉夾”、“魚(yú)茶釀苦瓜”等，另外，山蔞葉還可用來(lái)爆炒、紅燒、干煸、煲煮各色肉品，使菜肴口味醇厚濃香，深受食客歡迎[1-4]。據(jù)測(cè)定，山蔞葉的維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦質(zhì)元素營(yíng)養(yǎng)含量豐富，尤其是山婁葉中鈣、鐵、鋅、錳和鍶的含量很高，屬于超鈣富鉀、富鋅超鐵蔬菜，除具有獨(dú)特的風(fēng)味外，還具有良好的保健功能[5]。此外，山蔞具有一定的藥用價(jià)值，可以全株、根、葉或果實(shí)入藥。藥性辛，溫。溫中散寒，祛風(fēng)利濕，消腫止痛。用于胃腸寒痛、風(fēng)寒咳嗽、水腫、瘧疾、牙痛、腳氣、痔瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疝氣痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷[2]。因此，不論是作為熱帶特色的香菜，還是作為藥用植物，其開(kāi)發(fā)前景都十分廣闊。

山蔞繁殖可以用扦插、壓條、種子進(jìn)行繁殖[6]，但常規(guī)繁殖方法使用的繁殖材料多，繁殖速度慢，不利于大規(guī)模推廣種植。而采用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行繁殖，使用起始繁殖材料少，繁殖速度快，而且可以在一定的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，能在短期內(nèi)滿足大規(guī)模推廣種植需要[7-8]。目前，對(duì)山蔞的組織培養(yǎng)研究尚未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。因此，本文利用山蔞單芽莖段通過(guò)叢生芽途徑進(jìn)行快繁，旨為山蔞的擴(kuò)大種植和開(kāi)發(fā)利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自海南大學(xué)（儋州校區(qū)）農(nóng)學(xué)院苗圃基地以及海南大學(xué)（儋州校區(qū)）園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。2012年7月取野外生長(zhǎng)的山蔞進(jìn)行室內(nèi)盆栽，待嫩莖長(zhǎng)出后取材；另于2013年3～7月連續(xù)晴天數(shù)天時(shí)，上午取材，選取生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的嫩莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體的表面消毒與接種 將采集的山蔞嫩莖剪成長(zhǎng)為3 cm左右的單芽莖段，清水浸泡10～20 min，然后轉(zhuǎn)移到洗衣粉水中浸泡15 min，再用流水沖洗30 min后，放入含有多菌靈的溶液中浸泡30 min，再用流水沖洗1 h，用吸水紙慮干備消毒處理。消毒時(shí)先用70%酒精浸泡單芽莖段30 s，然后在轉(zhuǎn)移到0.1%升汞溶液（滴有2～3滴吐溫）中處理3～12 min。將消毒處理后的外植體用無(wú)菌水沖洗4～5次，用滅菌濾紙濾干后放在超凈工作臺(tái)上備用。接種時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將單芽莖段修剪成1 cm左右，插入滅菌培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次，于接種15 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率以及存活率，選擇最佳消毒方式。污染率/%=污染的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100；褐化率/%=未污染的褐變外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100；存活率/%=存活的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.2.2 初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)使用的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0～0.5 mg/L NAA（1-naphthaleneacetic acid）+0～4 mg/L 6-BA（6-benzylaminopurine）。每個(gè)處理組合接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率。萌芽率/%=產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/總的接種外植體數(shù)×100。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)生長(zhǎng)出來(lái)的腋芽接種于附加0～0.2 mg/L NAA、0～4 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=繼代增殖培養(yǎng)1個(gè)周期后產(chǎn)生的芽數(shù)/增殖培養(yǎng)前轉(zhuǎn)接的芽數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將長(zhǎng)至適當(dāng)高度的苗芽接種于附加0～3 mg/L NAA、0～0.5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)，20 d后觀察生根狀況并統(tǒng)計(jì)生根率和平均生根長(zhǎng)度。生根率/%=生根苗數(shù)/總的接種株數(shù)×100，平均根長(zhǎng)（cm）=根總長(zhǎng)/生根數(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基均附加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂粉，pH值滅菌前調(diào)至5.8；培養(yǎng)基在滅菌鍋里滅菌的溫度、時(shí)間分別為121 ℃、30 min；培養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光周期16 h/8 h（晝/夜）。

1.2.6 煉苗移栽 將生根發(fā)育良好的組培苗連同培養(yǎng)瓶移到室外遮陰棚中進(jìn)行閉瓶煉苗10 d左右，然后將培養(yǎng)瓶的蓋子打開(kāi)，在自然光下進(jìn)行開(kāi)瓶煉苗5 d左右。試管苗移栽時(shí)用鑷子小心取出，用無(wú)菌水沖洗根部附著的培養(yǎng)基成分，并用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗，把生根苗移栽到黏土：河沙（1 ∶ 1）基質(zhì)中，然后進(jìn)行常規(guī)管理。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)中所獲得的各處理數(shù)據(jù)均先用反正弦函數(shù)代換，再進(jìn)行方差分析，在p<0.05水平上，用Duncan法做多重比較[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒

直接從野外采集外植體進(jìn)行消毒，無(wú)論如何處理，污染率極高，幾乎得不到無(wú)菌材料。采用室內(nèi)盆栽植株的外植體進(jìn)行消毒處理的結(jié)果見(jiàn)表1。未進(jìn)行消毒處理的對(duì)照組，接種材料全部污染，褐化率和成活率均為0。隨著消毒時(shí)間的增加，污染率由升汞消毒3 min的100%逐漸降低，到消毒12 min時(shí)只有8.3%；而褐化率在處理3～6 min時(shí)均為0，之后逐漸升高，消毒12 min時(shí)達(dá)到73.3%；而成活率也隨消毒時(shí)間的增加而提高，在處理8（升汞消毒9 min）達(dá)到最高，顯著高于其他處理，之后隨著消毒時(shí)間的增加，成活率呈下降趨勢(shì)。

2.2 初代培養(yǎng)

由表2可知，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率大體上隨6-BA濃度的增加而增加。處理14，即MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA處理所得的萌芽率最高，達(dá)到78.3%，顯著高于其他處理。當(dāng)6-BA濃度為0，NAA濃度為0.25 mg/L及0.5 mg/L時(shí)，處理所得萌芽率次低和最低，分別達(dá)11.7%和10%，顯著低于其他處理。

2.3 繼代培養(yǎng)

如同在初代培養(yǎng)中的情況，在相同NAA濃度的不同組處理中，繼代增殖率隨6-BA濃度的增加而增加。由表3可知，處理10（MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA）的增殖系數(shù)為3.3，顯著高于除處理9（MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）外的其它處理。在NAA濃度為0.1 mg/L或0.2 mg/L但不附加6-BA的情況下，可能由于生長(zhǎng)素NAA對(duì)增殖的抑制作用，未見(jiàn)增殖芽產(chǎn)生；而6-BA濃度達(dá)到4 mg/L時(shí)，基部產(chǎn)生的愈傷組織較嚴(yán)重，產(chǎn)生的苗也較弱（結(jié)果未顯示）。綜合來(lái)看，處理9的增殖效果較好。

2.5 生根培養(yǎng)

由表4可知，山蔞苗芽生根率在各NAA和6-BA濃度組合中隨生長(zhǎng)素NAA濃度的增加而增加，而且附加一定量的6-BA更有利于生根。處理15（1/2MS+3 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA）、14（1/2MS+3 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA）和處理16（1/2MS+3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA）的生根率分別為95%、83.3%和81.7%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，這3個(gè)處理差異不顯著，但與其他處理的差異均達(dá)到顯著。處理14的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，除了與處理10、處理15以及處理16之間的差異不顯著外，與其余各組處理之間的差異均顯著。但各處理的生根數(shù)都只有1～2條。

煉苗移栽結(jié)果表明，山蔞試管苗移栽成活率可以達(dá)到95%以上。

3 討論與結(jié)論

外植體的消毒處理是決定組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。由于山蔞野生于高溫陰濕的橡膠林下，從野生環(huán)境中采集的外植體不可避免地?cái)y帶大量的外生菌和內(nèi)生菌，內(nèi)部污染是極難進(jìn)行表面消毒的。本試驗(yàn)從野生環(huán)境中取材表面消毒幾乎無(wú)法成功，這與同屬的栽培胡椒組織培養(yǎng)中外植體的污染問(wèn)題類(lèi)似[11]。只有將野生植株移栽到潔凈環(huán)境采集新長(zhǎng)出的外植體，才獲得成功。0.1%升汞溶液是一種強(qiáng)效滅菌劑，雖然隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率會(huì)降低，但在殺滅外植體菌種的同時(shí)，亦可能對(duì)外植體本身產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致外植體接種后出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并在某個(gè)處理時(shí)間之后降低成活率。這也是本試驗(yàn)中0.1%升汞消毒10 min以上處理反而使褐化率和成活率降低的原因。

利用山蔞單芽莖段進(jìn)行啟動(dòng)和增殖培養(yǎng)中，6-BA發(fā)揮極其重要的作用，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率和增殖率大體上隨6-BA濃度的增加而增加；在附加生長(zhǎng)素NAA而不附加6-BA的情況下，增殖系數(shù)均為0。同時(shí)觀察到，6-BA與NAA組合要比單獨(dú)使用6-BA對(duì)啟動(dòng)和增殖培養(yǎng)的效果好。這與同屬植物栽培胡椒的組織培養(yǎng)情況類(lèi)似[12-13]。

由于胡椒屬植物難以表面消毒（尤其是內(nèi)源性污染）和容易褐化，胡椒屬中不同物種的組織培養(yǎng)的難易程度具有物種和基因型的依賴性，因此，胡椒屬植物仍然是目前較難組織培養(yǎng)的植物之一。在胡椒屬植物莖尖和莖段培養(yǎng)方面，除劉進(jìn)平等[12-13]對(duì)大葉種胡椒進(jìn)行組織培養(yǎng)外，Mathew等[14]對(duì)胡椒的一個(gè)雜種Panniyr 1的無(wú)菌萌發(fā)實(shí)生苗莖尖進(jìn)行了培養(yǎng)，在MS+1 mg/L IAA（3-indolylacetic acid）+1 mg/L 6-BA上實(shí)現(xiàn)叢生芽增殖；Philip等[15]對(duì)6年生的胡椒品種Panniyur-1、Karimunda和Arivalli大田苗的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，在附加或不附加160 mg/L AdSO4的MS+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上可增殖成芽。而B(niǎo)hat等[16]在對(duì)胡椒屬的3個(gè)種胡椒（P. nigrum）、P. betel和P. longum的根、葉、節(jié)和節(jié)間外植體的形態(tài)發(fā)生潛力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)P. colubrinum的反應(yīng)最好，其次為P. betel和胡椒（P. nigrum），并且發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)芽的誘導(dǎo)優(yōu)于KT（kinetin）。本文對(duì)胡椒屬植物山蔞（P. sarmentosum）組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，利用室內(nèi)萌芽抽條作外植體，有效克服了不能獲得無(wú)菌培養(yǎng)的困難，同時(shí)，6-BA與NAA組合可實(shí)現(xiàn)叢生芽增殖。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，山蔞幼嫩莖段最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞溶液消毒9 min；啟動(dòng)培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA為宜；繼代增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+ 0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；生根培養(yǎng)基采用1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根效果較好。利用本試驗(yàn)結(jié)果可成功地對(duì)山蔞進(jìn)行組織培養(yǎng)和快速繁殖，這將為山蔞大規(guī)模推廣種植打下種苗工廠化生產(chǎn)的技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉進(jìn)平. 海南野生胡椒資源的開(kāi)發(fā)利用[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)， 2010， 50（2）： 35-36

[2] 劉進(jìn)平.新型熱帶香菜植物--山蔞[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)， 2013， 53（4）： 50.

[3] 劉進(jìn)平. 海南胡椒屬植物商品化開(kāi)發(fā)利用探討[C]. 中國(guó)熱帶作物學(xué)會(huì)遺傳育種專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2013年度學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集， 貴陽(yáng)， 2013， 9： 55-56.

[4] 劉進(jìn)平. 海南島特色菜--山蔞葉系列菜品的開(kāi)發(fā)[J]. 烹調(diào)知識(shí)， 2011（4）： 13.

[5] 劉進(jìn)平， 黃東益， 成善漢. 新型熱帶香菜山蔞葉的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2013， 34（4）： 362-364.

[6] 王 航， 李振宏， 劉進(jìn)平， 等. 山蔞及其他海南胡椒屬野生植物扦插生根技術(shù)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（28）： 201-204.

[7] 鄭成木， 劉進(jìn)平. 熱帶亞熱帶植物微繁殖[M]. 長(zhǎng)沙： 湖南科學(xué)技術(shù)出版， 2001.

[8] 劉進(jìn)平. 植物細(xì)胞工程簡(jiǎn)明教程[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2005.

[9] Compton M E. Statistical methods suitable for the analysis of plant cell tissue culture data[J]. Plant Cell Tissue Organ Cult， 1994， 37： 217-242.

[10] Duncan D B. Multiple range and multiple F test[J]. Biometrics， 1995， 11： 1-4.

[11] 劉進(jìn)平. 胡椒組織培養(yǎng)中污染問(wèn)題的研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003， 23（6）： 6-10.

[12] 劉進(jìn)平， 鄭成木. 胡椒組織培養(yǎng)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 22（3）： 18-22.

[13] 劉進(jìn)平， 鄭成木. 大葉種胡椒實(shí)生苗莖尖培養(yǎng)和合子胚培養(yǎng)研究[J]. 廣西植物， 2005， 25（5）： 459-463.

[14] Mathews V E， Rao P S. In vitro responses of black pepper（Piper nigrum）[J]. Current Science， 1984， 53（4）： 183-186.

[15] Philip V J， Joseph D， Triggs G S， et al. Micropropagation of black pepper（Piper nigrum Linn.）through shoot tip cultures[J]. Plant Cell Reports， 1992， 12： 41-44.

[16] Bhat S R， Chandel K P S， Malik S K. Plant regeneration from various explants of cultivated Piper species[J]. Plant Cell Reports， 1995， 14： 398-402.