龍眼果干蛋白組成及不同組份特性比較

卜智斌等

摘 要 以龍眼果干為原料，利用堿溶酸沉法提取龍眼果干粗蛋白，并測定其等電點(diǎn)，研究不同等電點(diǎn)龍眼蛋白的含量及其氨基酸組成，配制人工胃液以模擬不同等電點(diǎn)龍眼蛋白的體內(nèi)消化情況，測定等電點(diǎn)粗蛋白及其模擬體內(nèi)消化液的總抗氧化能力。結(jié)果表明：龍眼蛋白提取過程中的最佳浸泡時(shí)間為2 h，其等電點(diǎn)為pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0，其中pI3.0、pI4.0、pI5.0組份蛋白含量分別占果肉總蛋白的12.69%、21.68%、17.12%， 均含有16種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸；不同等電點(diǎn)組份蛋白及其消化液總抗氧化能力有所不同，pI5.0粗蛋白的總抗氧化能力為276.33 U/mg Protein，顯著高于另外2組等電點(diǎn)蛋白，而粗蛋白消化液總抗氧化能力最高為pI4.0蛋白，達(dá)154.72 U/mg Protein。

關(guān)鍵詞 龍眼干；等電點(diǎn)；氨基酸；體外模擬消化；抗氧化

中圖分類號 S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Alkali-solution and acid-isolation methods were carried out to determination the isoelectric point of dried longan protein， to analyse the composition of different pI proteins from dried longan fruit， in vitro digestion of longan proteins in different pI was conducted in a simulated digestion environment and compared the total antioxidant activity of different pI protein and its digestive fluid. The results demonstrated that： the best extracting time for longan pulp static leaching was two hours； pH3.0， pH3.5， pH4.0， pH4.5， pH5.0 were the isoelectric points of dried longan fruit proteins， and the relative percentages of longan proteins in pI3.0， pI4.0， pI5.0 component from total dried longan fruit protein was 12.69%， 21.68% and 17.12% respectively， all including 16 amino acids with seven essential amino acids； Proteins and its digestive fluid in different pI had different total antioxidant capacity，and the pI5.0 component had the highest total antioxidant capacity， 276.33 U/mg Protein， while the digestive fluid of the pI4.0 component had the highest total antioxidant capacity compared to the others.

Key words Dried longan fruit；Isoelectric point；Amino acid；In vitro digestion；Antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.020

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）又名“桂圓、益智”，是無患子科龍眼屬植物，為中國南方典型的亞熱帶水果之一。龍眼肉營養(yǎng)豐富，含有大量多酚、多糖、類黃酮等天然生物活性物質(zhì)，是藥食兩用的滋補(bǔ)佳品[1]。中醫(yī)認(rèn)為，龍眼味甘、性溫，入心脾兩經(jīng)，具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血寧神等功效[2]，這與中國最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中所言龍眼“久服強(qiáng)魂聰明，輕身不老，通神明”之說相吻合。現(xiàn)代研究結(jié)果表明，龍眼具有抗氧化、抗衰老、抗應(yīng)激、抗焦慮、影響內(nèi)分泌等作用。

目前對龍眼果肉的研究主要集中在多酚、多糖類物質(zhì)的分離、提取、純化、功能活性評價(jià)方面[3-4]及龍眼干制加工研究[5]。龍眼功效的研究則多以龍眼肉提取液作為研究對象，如農(nóng)興旭等[6]、王慧琴等[7]用龍眼肉提取液通過體外及體內(nèi)試驗(yàn)對龍眼肉的抗應(yīng)激和抗衰老能力進(jìn)行了研究。以龍眼肉提取液作為研究對象的缺點(diǎn)在于提取液中含有眾多的物質(zhì)，如多糖、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等，因此不能明確其作用機(jī)制。氨基酸是一種很重要的營養(yǎng)成分， 也是果實(shí)風(fēng)味的重要物質(zhì)[8]，與風(fēng)味物質(zhì)的合成密切相關(guān)，同多糖等其他大分子物質(zhì)結(jié)合影響龍眼的藥食功效作用，對龍眼干的品質(zhì)影響較大[9]，另外，氨基酸與美拉德反應(yīng)、褐變的發(fā)生密切相關(guān)，對龍眼的感官品質(zhì)也有著直接的影響[10-11]。

而有關(guān)龍眼果肉蛋白、氨基酸這一類低成分含量物質(zhì)的研究較少，主要是研究其氨基酸組成和含量測定，如戴宏芬等[12]采用高效液相色譜（HPLC）測定18個(gè)龍眼品種鮮果肉的氨基酸組成及含量；黃愛萍等[8]研究了果實(shí)采后低溫貯藏過程中龍眼果肉氨基酸含量的變化。對于其等電點(diǎn)及活性性能方面的研究尚未見詳細(xì)報(bào)道。實(shí)際上龍眼干制在由高水分含量降低至含水量15%以下的過程中，果肉中的蛋白質(zhì)與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)等一系列復(fù)雜的反應(yīng)，包括蛋白糖基化過程[13]，蛋白糖基化改性可顯著改善蛋白質(zhì)的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠性、粘度等各種性質(zhì)，并能影響龍眼的抗氧化性、抗菌性、免疫活性等生物功能作用[14]。

在本試驗(yàn)中，主要研究龍眼果干蛋白的提取方法，初步分析確定龍眼果干蛋白粗提的最佳提取浸泡條件，對提取的不同等電點(diǎn)的粗蛋白進(jìn)行體外模擬消化，測定其氨基酸成分和抗氧化能力等，旨在了解龍眼果干蛋白的組份和不同組份基本功能特性，為后續(xù)從蛋白質(zhì)組學(xué)角度深入研究龍眼干的功能變化提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 龍眼果干為“儲良”品種，購于廣州某農(nóng)貿(mào)市場，測定果肉中蛋白質(zhì)含量為（3.66±0.22）%，水分含量為（8.09±0.03）%。

1.1.2 試劑 氫氧化鈉（分析純）、濃硫酸（分析純）、濃鹽酸（分析純）、消化劑（由FOSS福斯分儀儀器公司配套）、重蒸苯酚（分析純）、檸檬酸鈉（分析純）、高純氮?dú)狻⒗鋬鰟ū鶋K）、冰乙酸（分析純）、胃蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司，型號：YY10520），總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器設(shè)備 PB-10型pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、10014133型FOSS消化爐（FOSS TecatorTM Digestor）、KjeltecTM8400自動凱式定氮儀（瑞典福斯分儀儀器公司）、Thermo scientific臺式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）、ALC-210.4分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、Free zone 7948030冷凍真空干燥機(jī)（LABCONCO/美國）、KDB-12型多功能吹氮儀（青島科迪博電子科技有限公司）、DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、真空干燥器（艾力特國際貿(mào)易有限公司）、L-8900型全自動氨基酸分析儀（HITACHI/日本）、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、UV-1800紫外分光光度計(jì)（島津）、N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Tokyo Rikakikai Co.， Ltd）。

1.2 方法

1.2.1 龍眼果干蛋白提取的最佳浸泡時(shí)間的確定 取40 g龍眼果干，加入140 g蒸餾水，打漿均質(zhì)后分成6等份，每份25 g，調(diào)pH至7.00，分別靜置0、2、4、6、8、10 h后過濾，取上清液10 mL定容至50 mL，用自動凱氏定氮儀測定其蛋白質(zhì)含量，確定龍眼粗蛋白提取的最佳時(shí)間，所有試驗(yàn)平行進(jìn)行3次。

1.2.2 龍眼果干蛋白等電點(diǎn)的確定[15] 取130 g龍眼果干，加入6 500 mL水，打漿均質(zhì)后分成13等份，浸泡2 h，用1 mol/L的氫氧化鈉和2 mol/L鹽酸分別調(diào)pH至3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，靜置30 min后過濾，濾液定容至50 mL，用自動凱氏定氮儀測定其蛋白質(zhì)含量，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到龍眼粗蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

1.2.3 龍眼果干粗蛋白的提取 取500 g龍眼果干肉，粉碎機(jī)粉碎后加入1 600 g蒸餾水，調(diào)pH值至8.0，浸泡2 h后抽濾，取濾液調(diào)pH至3.0、4.0、5.0，靜置2 h后離心（10 000 r/min，10 min），去除上清液，取沉淀物冷凍干燥得粗蛋白粉。

1.2.4 蛋白質(zhì)、氨基酸含量測定 蛋白質(zhì)含量的測定參考GB5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》中的《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法，氨基酸含量的測定參考GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》的方法。

1.2.5 模擬不同等電點(diǎn)的龍眼果干粗蛋白在體內(nèi)的消化過程 取稀鹽酸（濃鹽酸23.4 mL用蒸餾水定容至100 mL）16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1 000 mL得到人工胃液。將預(yù)熱至37 ℃的人工胃液與不同等電點(diǎn)龍眼粗蛋白按體積（mL） ∶ 質(zhì)量（g）=1 000 ∶ 1的比例加入試管中，置于37 ℃恒溫水浴鍋消化30 min。

1.2.6 不同等電點(diǎn)的龍眼果干粗蛋白的總抗氧化能力測定 總抗氧化能力測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體操作方法參考試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼干蛋白的等電點(diǎn)測定

2.1.1 龍眼干蛋白提取最佳時(shí)間的測定 不同龍眼干加水打漿后浸泡時(shí)間對蛋白質(zhì)提取含量的影響見圖1。從圖1中可以看出，0～2 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的增加，上清液蛋白質(zhì)含量逐漸增加；當(dāng)浸泡時(shí)間在2 h時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高；當(dāng)浸泡時(shí)間大于2 h時(shí)，蛋白質(zhì)含量基本趨于穩(wěn)定。這說明浸泡2 h后龍眼干中的蛋白質(zhì)與其他雜質(zhì)分離效果最好，因此，在后續(xù)提取龍眼干蛋白的操作中選定2 h為最佳浸泡時(shí)間。

2.1.2 龍眼干蛋白等電點(diǎn)的測定 不同pH對龍眼干蛋白溶解性的影響見圖2。由圖2可知，pH值在3.0、3.5、4.0、4.5、5.0時(shí)，上清液中所測得的蛋白質(zhì)含量明顯低于其他pH值，且含量相差不大。由于龍眼果肉中包含許多不同種類的蛋白，不同組份其等電點(diǎn)也有所不同，因此，可以得出龍眼蛋白沉降較多的5個(gè)pH值pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0為龍眼果肉蛋白的等電點(diǎn)。

2.2 不同等電點(diǎn)提取的龍眼干蛋白含量占果肉蛋白總含量的比例測定

由圖3可知，不同等電點(diǎn)提取粗蛋白含量相對于龍眼干果肉總蛋白的比例，經(jīng)冷凍干燥后得到的pI3.0、pI4.0、pI5.0組份粗蛋白質(zhì)量分別為8.27、15.12、14.15 g，通過凱氏定氮法測得粗蛋白中的蛋白質(zhì)含量分別為25.64%、23.79%、20.09%。通過換算得到不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)含量占龍眼果干總蛋白含量的12.69%、21.68%、17.12%，這3部分的蛋白質(zhì)占龍眼果干總蛋白的51.49%，推測其他48.5%的蛋白質(zhì)應(yīng)為其他等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)及不能用堿溶酸沉法提取的其他類型蛋白質(zhì)。

2.3 不同等電點(diǎn)提取的龍眼干粗蛋白中氨基酸組成

利用氨基酸分析儀測定不同等電點(diǎn)龍眼蛋白中的氨基酸組成，結(jié)果見表1。在不同等電點(diǎn)的龍眼蛋白成分測定中，均檢測出16種游離氨基酸，其中在pI4.0中，還檢測出了其他2個(gè)等電點(diǎn)中所沒有的半胱氨酸。在檢測出的16種氨基酸成分中，谷氨酸的含量在每個(gè)等電點(diǎn)蛋白中都是最高的，其在pI3.0、pI4.0、pI5.0 3個(gè)等電點(diǎn)中的含量分別為3.17、2.19、1.50 g/100 g。從表1中可以看出，隨著等電點(diǎn)的升高，除半胱氨酸外，各種氨基酸的含量依次降低。龍眼等電點(diǎn)蛋白中含有8種人體必需氨基酸，其含量由高到低依次為：亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸，它們占pI3.0、pI4.0、pI5.0等不同等電點(diǎn)氨基酸的比例分別為47.32%、42.91%、45.12%。

2.4 不同等電點(diǎn)提取的龍眼干粗蛋白模擬體內(nèi)消化試驗(yàn)結(jié)果

消化率是機(jī)體消化吸收的食物量占食物總攝入量的百分比，是評價(jià)食物營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)配制人工胃液胃腸道環(huán)境，將不同等電點(diǎn)龍眼蛋白冷凍干燥后按人工胃液體積（mL）∶ 龍眼蛋白質(zhì)量（g）=1 000 ∶ 1的比例，37 ℃恒溫消化30 min以模擬體內(nèi)消化，評價(jià)龍眼蛋白的體外胃消化能力。由表2可知，不同等電點(diǎn)龍眼蛋白在胃液里面的消化能力在消化所需時(shí)間和消化完成程度上都有明顯不同，它們的消化能力強(qiáng)弱依次為：pI3.0

2.5 不同等電點(diǎn)龍眼干粗蛋白及其消化液總抗氧化能力測定

抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫克組織蛋白，使反應(yīng)的吸光度（OD）值，每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位（U/mg Protein）。由圖4可知，3個(gè)等電點(diǎn)的龍眼蛋白及其消化液均具有一定的總抗氧化能力。pI5.0組份的龍眼粗蛋白具有最強(qiáng)的總抗氧化能力，其次為pI4.0，而pI3.0粗蛋白的總抗氧化能力最小。結(jié)合上述消化試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，消化能力較好的粗蛋白的抗氧化能力較強(qiáng)，這可能由于pI5.0組份粗蛋白在消化前就含有較多的小分子蛋白、多肽片段，使得其消化能力表現(xiàn)較好，而消化能力里較弱的pI3.0和pI4.0組份粗蛋白中的小分子蛋白和多肽片段則相應(yīng)較少。另外，小分子蛋白和多肽片段中暴露出來的活性位點(diǎn)更多，使得其抗氧化能力要強(qiáng)于大分子蛋白[16]，所以才會出現(xiàn)消化能力較好的粗蛋白組份有較高的抗氧化活性。

對于模擬消化液的抗氧化能力分析結(jié)果與粗蛋白不同，pI4.0組份蛋白消化液的總抗氧化能力最強(qiáng)，其次為pI3.0、pI5.0。出現(xiàn)這種結(jié)果大致可以歸因于粗蛋白中的小分子蛋白和短肽在過度消化過程中會過量分解成氨基酸，一般說來， 肽類的抗氧化能力大于氨基酸[16]，而最容易消化的pI5.0 相比pI3.0、pI4.0組份粗蛋白含有更多的小分子蛋白或者多肽，在消化過程中更快也更容易被分解為氨基酸甚至降解，從而影響其抗氧化活性，使得其總抗氧化最弱，而使得pI3.0和pI4.0組份蛋白經(jīng)過適量的消化時(shí)間后其抗氧化活性較高。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)提取過程中不同浸泡時(shí)間影響粗蛋白的提取量和提取率，本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同浸泡時(shí)間對龍眼蛋白的提取有一定的影響，龍眼果干蛋白浸泡2 h即可達(dá)到最大提取，而動物蛋白由于含有大量油脂及結(jié)締組織，提取工藝時(shí)間長[17]，說明龍眼蛋白的提取與動物蛋白提取存在一定的差異。對龍眼果干蛋白的研究結(jié)果表明，龍眼果干蛋白含有不同的等電點(diǎn)，分別是pI3.0、pI3.5、pI4.0、pI4.5、pI5.0，不同等電點(diǎn)的龍眼果干粗蛋白在氨基酸組成和含量上均有所差異。

通過選取具有代表性的pI3.0、pI4.0 、pI5.0龍眼果干蛋白組份來分析其氨基酸組成及抗氧化性能，結(jié)果表明，對不同等電點(diǎn)龍眼粗蛋白的消化程度不同，順序?yàn)閜I5.0>pI4.0>pI3.0；且pI5.0組份的龍眼粗蛋白具有最強(qiáng)的總抗氧化能力，其次為pI4.0，而pI3.0粗蛋白總抗氧化能力最?。欢谀M消化液中，pI4.0組份的消化液總抗氧化能力最強(qiáng)，這可能與不同組份蛋白的多肽組成及氨基酸不同有關(guān)；同時(shí)由于龍眼蛋白的提取方法為“堿溶酸沉”法，在浸泡過程中可能存在色素、多酚多糖等具有活性作用的物質(zhì)干擾，影響后續(xù)的蛋白質(zhì)抗氧化分析，其不同蛋白組份的活性評價(jià)有待于通過動物試驗(yàn)或體外模擬試驗(yàn)進(jìn)一步研究，或者測定不同等點(diǎn)組份蛋白的多肽組成及分子量分布情況來進(jìn)一步分析抗氧化情況。此外，經(jīng)過分析也表明，龍眼蛋白存在不同等電點(diǎn)組份，而且不同組份的蛋白在干制過程中糖基化反應(yīng)的進(jìn)展、產(chǎn)物也不同。如能深入分析不同組份在不同干制方法糖基化的產(chǎn)物及其活性，則將有助于揭示龍眼果干功能作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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