PRSV CP—VPg嵌合型ihpRNA干擾載體轉(zhuǎn)化番木瓜的抗性分析

王樹昌

摘 要 利用pCAMBIA3300載體為背景，構(gòu)建PRSV CP-VPg嵌合型植物表達干擾載體pCambia-hpRNA-CV，通過花粉管通道法將PRSV CP-VPg嵌合型植物表達載體遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜，并將獲得的轉(zhuǎn)化番木瓜種子依次進行除草劑（PPT）篩選、PCR檢測。結(jié)果表明：獲得轉(zhuǎn)基因番木瓜植株5株，且RT-PCR實驗證明了目標片段在轉(zhuǎn)基因株系中得到表達。采用人工摩擦接種法對轉(zhuǎn)基因番木瓜株系進行攻毒實驗，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因番木瓜植株對PRSV病毒表現(xiàn)出抗病特性，說明hpRNA-CV成功的干擾了病毒基因的復(fù)制。該研究結(jié)果為番木瓜抗PRSV育種提供了一種有效的研究手段。

關(guān)鍵詞 番木瓜；嵌合型ihpRNA；花粉管通道法轉(zhuǎn)化；PRSV

中圖分類號 Q949.759.6 文獻標識碼 A

Abstract A plant expression vector containing the chimeric hairpin RNA designed to target two sequences from the CP gene and the VPg gene of PRSV was transferred into papaya plants through pollen-tube pathway， which was constructing base on the pCAMBIA3300 vector. A total of 5 positive transgenic papaya plants were obtained after PPT-resistant selection and PCR analysis. RT-PCR experiments proved that the target segment expressed in the transgenic plants. The result of PRSV challenge-inoculation confirmed the 5 positive transgenic papaya plants didn't displayed symptoms and showed different degrees of resistance to PRSV. Its shown that hpRNA-CV vector interferes the replication of the virus gene successfully. The research provides an effective method for PRSV resistance-breeding of papaya.

Key words Papaya；IhpRNA；Pollen-tube pathway；PRSV

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.011

番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是熱帶、亞熱帶地區(qū)的毀滅性嚴重的病害，一直威脅著番木瓜種植業(yè)和加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，常規(guī)育種方法還難以防控PRSV。隨著基因工程抗病分子育種的發(fā)展，國內(nèi)外研究人員先后將PRSV外殼蛋白、復(fù)制酶等基因?qū)敕竟汐@得了不同的抗PRSV的轉(zhuǎn)基因株系[1-2]，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于各地區(qū)PRSV病毒株存在差異，導(dǎo)致一個地區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物在另一個地區(qū)種植表現(xiàn)出的抗病能力減弱，甚至抗性喪失。因此，培育出穩(wěn)定、高抗、譜抗且安全性好的新品種對發(fā)展中國番木瓜產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。外殼蛋白（Coat Protein， CP）基因介導(dǎo)的病毒抗性是研究最早的，也是目前應(yīng)用最多的抗病毒基因工程，主要的研究集中在體外構(gòu)建重組CP基因表達框，然后轉(zhuǎn)化植物，繼而使植物獲得對該病毒的抗性[3]。VPg是PRSV一種約25 ku的多功能蛋白，參與病毒侵染過程中的幾個階段，包括病毒RNA的復(fù)制、病毒細胞間和長距離運輸[4-9]，在病毒侵染過程中具有重要作用。在多種病毒侵染植物的過程中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)合成起始其重要作用的真核翻譯起始因子eIF4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E）[10]與病毒基因組連接蛋白（Viral genome-linked protein， VPg）的相互作用是病毒侵染植物的必須條件[4，9，11]。在前期的研究工作中，為了獲得高抗、譜抗的轉(zhuǎn)基因抗PRSV番木瓜，構(gòu)建了靶向PRSV基因上2個部位CP和VPg的嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)[12]，本研究將通過花粉管通道法將該嵌合基因的iphRNA植物表達載體遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜，獲得了對PRSV具有明顯的抗病特性的轉(zhuǎn)基因植株，為培育具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)、高抗譜抗環(huán)斑病毒番木瓜新品系提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗基地的番木瓜品種“穗中紅”作為轉(zhuǎn)化受體材料。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株、植物表達載體pCAMBIA3300均由本實驗室保存。

1.1.3 酶與試劑 各種限制性內(nèi)切酶購自Ferments公司，PCR Mix購自TaKaRa公司，質(zhì)粒、DNA和RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA植物表達載體的構(gòu)建與鑒定 利用重疊PCR技術(shù)，基于PRSV海南分離株CP基因和VPg基因保守序列，設(shè)計引物，擴增具有嵌合CP基因和VPg基因的嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)[12]。然后利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切位點，將嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)插入pCAMBIA3300植物表達載體（圖1），命名為pCambia-hpRNA-CV。采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建的pCambia-hpRNA-CV進行雙酶切鑒定。

1.2.2 質(zhì)粒大量提取和純化 按照QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒方法進行提取，獲得的質(zhì)粒DNA溶于ddH2O中，終濃度為1 μg/μL，A260/A280比值為1.8左右，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 花粉管通道法遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜 選取數(shù)朵未開苞的兩性花（作為轉(zhuǎn)化用的花粉源）置于冰上，在待轉(zhuǎn)化株（雌株）上選定30朵左右未開苞的花（剪去同一花柄上其余花朵），小心逐一剝開花瓣，用微量移液器在雌花花蕾柱頭中央點入3～4 μL重組質(zhì)粒溶液（1 μg/μL），立刻取預(yù)置于冰上的供體兩性花3～4枚雄蕊于柱頭上，合上花瓣，完成人工授粉后套上牛皮管袋隔離保濕，掛上標簽（注明導(dǎo)入質(zhì)粒名稱、導(dǎo)入日期及操作時間）；（同時用ddH2O為對照，也按上述要求作同步平行操作）。第7天去除牛皮管袋，清除枯萎花苞及其標簽，并登記正常生長的子房數(shù)。為保障轉(zhuǎn)基因操作番木瓜果實生長所需營養(yǎng)的供給，剔除植株頂端其他未進行轉(zhuǎn)化操作的花及果實。待果實發(fā)育成熟，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化果實發(fā)育座果率。將果實沿中央線縱切開，取出種子，去除假種皮后稍作晾干，播種沙床上育苗。

1.2.4 利用除草劑PPT對轉(zhuǎn)化番木瓜種苗進行初篩 待轉(zhuǎn)化番木瓜種苗第一片真葉伸展開時，利用120 mg/L PPT（1 L溶液中加入20 μL表面活性劑）涂抹幼苗葉片表面及生長點，隔天再涂抹1次。一周后觀察葉片反應(yīng)，剔除葉片變枯黃的株系。

1.2.5 PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因番木瓜抗PPT種苗DNA，利用基因片段兩側(cè)引物P1/P2（P1：5′- TTGGTGACGTGCGAAATAGA-3′；P2：5′-TCCAG

ACATATCTGGCTGTATTTTTTTAAT-3′）。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 RT-PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen RNA試劑盒小量提取其RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肨iangen公司KR106-2試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，以引物P1/P2進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

1.2.7 PRSV接種攻毒試驗 使用本實驗室分離保存的PRSV-HN株系，通過人工摩擦接種的手段侵染番木瓜植株。選擇長勢相似的番木瓜植株，用清水將葉片沖洗干凈，并保持液面干燥。用0.1 mol/L PBS緩沖液（pH7.0）制備PRSV-HN病毒液。取保存PRSV-HN菌株的葉片用PBS液體比例為1 ∶ 10（W ∶ V），研磨成汁，低速離心后，取上清液做為毒源，冰上放置待用。病毒液中加入適量滅菌好的石英砂，混勻；用帶乳膠手套的手指蘸取病毒液，沿同一方向輕輕摩擦轉(zhuǎn)ihpRNA番木瓜葉片背面，直至可見少量輕微擦痕。以轉(zhuǎn)pCambia3300的轉(zhuǎn)基因番木瓜為陰性對照。接種5 min后，用無菌水沖洗葉片上多余的病毒液和石英砂；40 d內(nèi)以每周為時間間隔，觀察病害發(fā)生情況并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCambia-hpRNA-CV植物表達載體的鑒定

將獲得的具有pCambia-hpRNA-CV的轉(zhuǎn)化菌落，擴大培養(yǎng)后提取其質(zhì)粒。由圖2可知，工程載體質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增后獲得了預(yù)期大小的目標條帶；利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切結(jié)果顯示得到了目標條帶，初步鑒定轉(zhuǎn)化菌落是正確的；將此單菌落送往測序，測序得到的核苷酸序列與目標序列一致。因此，表明目標片段已插入載體中，工程載體構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)化番木瓜抗PPT種苗的篩選

為得到合適的用于篩選轉(zhuǎn)化番木瓜苗的PPT濃度，將不同濃度PPT溶液涂抹于野生型番木瓜種苗的第一片展開的真葉，3 d后即可觀察葉片出現(xiàn)不同程度的萎蔫。由圖3可知，對照組新葉生長良好，PPT在30～60 mg/L濃度時，處理真葉出現(xiàn)黑斑，葉片萎蔫，但仍有綠色；而PPT濃度達到120 mg/L時，新長成的真葉即可全部萎蔫，效果最佳。一周后，對照組葉片生長旺盛，處理組葉片死亡，沒有新葉發(fā)出。因此，選擇120 mg/L PPT溶液作為篩選濃度。

將篩選獲得的最佳濃度的PPT溶液涂抹于轉(zhuǎn)化種苗第一片展開的真葉上，一周后去除葉子變枯的植株，統(tǒng)計獲得的番木瓜抗性苗。由表1可知，獲得番木瓜轉(zhuǎn)化抗性苗41株，轉(zhuǎn)化植株篩選效率為17.6% 。

2.3 轉(zhuǎn)化ihpRNA番木瓜種苗PCR鑒定

將抗生素篩選為陽性的41株番木瓜幼苗移栽入溫室，作為檢測對象，以提取的葉片基因組DNA為模板，以插入片段兩側(cè)引物進行PCR擴增，同時以載體質(zhì)粒作為陽性對照模板，以轉(zhuǎn)化有背景載體pCambia3300的轉(zhuǎn)基因植株作為負對照（沒有目標條帶的出現(xiàn)），進行PCR擴增檢測，將獲得目標大小片段的轉(zhuǎn)化番木瓜植株作為陽性株系（圖4），本實驗最終獲得pCambia-hpRNA-CV轉(zhuǎn)基因苗5株。

2.4 轉(zhuǎn)化ihpRNA番木瓜種苗RT-PCR驗證

提取PCR鑒定為陽性的5株番木瓜植株葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為陽性，目標片段在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)獲得穩(wěn)定表達，目標片段成功轉(zhuǎn)入番木瓜內(nèi)（圖5）。轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)、生長發(fā)育狀態(tài)等方面與非轉(zhuǎn)基因植株無明顯差異。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株抗病性分析

通過分子檢測鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因株系生長至約50 cm高時，接種PRSV病毒，3周后發(fā)現(xiàn)，對照組（轉(zhuǎn)pCambia3300株系，見圖6-A）番木瓜植株頂部葉片出現(xiàn)明顯的番木瓜環(huán)斑病癥狀，葉片由剛開始出現(xiàn)水漬斑點，逐漸葉片開始卷曲，新生葉片也出現(xiàn)卷曲，呈發(fā)病狀態(tài)；ihpRNA載體的植株發(fā)病時間晚于對照組（圖6-C、D），且發(fā)病癥狀明顯減輕，有的株系新生葉逐漸回復(fù)正常。

3 討論與結(jié)論

運用RNAi干擾技術(shù)進行植物抗病毒工程，通常都是針對目標基因單一位點的RNAi干擾載體的構(gòu)建，但病毒基因組小，變異周期相對較短，因此采用針對單一位點的干擾不能滿足實踐需要。本研究采用的嵌合型ihpRNA載體具有可同時靶向多個基因或一個基因的多個部位的優(yōu)點，這就可能增強轉(zhuǎn)基因植株對目標基因的干擾效率；另一方面，即使生物體發(fā)育過程中基因發(fā)生位點突變，嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)仍然能夠?qū)ζ溥M行有效的干擾。

針對抗PRSV病毒的育種工作已有多年，基本都是圍繞CP基因和PRSV復(fù)制酶基因展開的，主要的研究集中在體外構(gòu)建重組CP基因表達框，然后轉(zhuǎn)化植物，繼而獲得對該病毒的抗性[12]。國內(nèi)外很多學(xué)者針對番木瓜PRSV病毒展開了研究，也取得了一定的成果。夏威夷大學(xué)的科學(xué)家們[13]將溫和突變體PRSV-CP基因?qū)敕竟?，成功獲得抗PRSV的轉(zhuǎn)基因植株，在2 a內(nèi)無癥狀，但其抗性水平較低。張帆等[14]針對PRSV-CP基因設(shè)計dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化番木瓜植株，結(jié)果表現(xiàn)為抗PRSV。雖然這些轉(zhuǎn)基因番木瓜能夠抗PRSV病毒，但其抗性范圍窄，而且PRSV株系存在顯著區(qū)域差異。針對番木瓜轉(zhuǎn)基因育種中的這些問題，本研究針對PRSV海南分離株，采用融合基因（CP基因和Vpg基因）構(gòu)建ihpRNA載體，進而轉(zhuǎn)化番木瓜，以期獲得廣譜的抗病性番木瓜；通過本實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗病活性，但其抗病活性能持續(xù)多久，后代是否會產(chǎn)生衰減現(xiàn)象，有待于進一步研究。

對于番木瓜的遺傳轉(zhuǎn)化來說，由于其再生體系尚不完善，轉(zhuǎn)化率低，利用愈傷組織農(nóng)桿菌及基因槍轉(zhuǎn)化率低，很難獲得轉(zhuǎn)基因植株。這些條件的限制使得農(nóng)桿菌、基因槍法轉(zhuǎn)化體系在番木瓜育種中很難得到推廣；另一方面，番木瓜是兩性株、花型大、種子豐富（每個果實少則數(shù)十顆，多則數(shù)百顆種子，能夠保證獲得足夠的轉(zhuǎn)化種子）、收獲周期短等性狀特征，使得利用花粉管通道法進行番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化成為較好的遺傳轉(zhuǎn)化方法。此外，子房滴注法操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，易于被育種工作者所掌握，便于此項技術(shù)的大面積推廣應(yīng)用。

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