枯草芽孢桿菌T122F菌劑對香蕉的生物效應(yīng)研究

甘林 陳漢鑫 楊留水 阮宏椿 杜宜新 石妞妞 陳福如 楊秀娟

摘 要 采用室內(nèi)與田間試驗相結(jié)合的方法研究了枯草芽孢桿菌T122F菌劑對香蕉生物效應(yīng)的影響。結(jié)果表明：菌劑能明顯促進香蕉生長，主要表現(xiàn)為香蕉株高、假莖周長、葉片數(shù)以及葉綠素含量的增加。菌劑的施用還能顯著提高香蕉內(nèi)生細菌數(shù)量、葉片耐菌能力和根際土壤細菌數(shù)量。在300倍液處理下，從香蕉苗根部分離到的菌量為299.75×103 cfu/g FW，是對照的7.16倍，而從香蕉根際土壤中分離到的菌量則是對照的2.20倍。此外，經(jīng)菌劑處理的香蕉根際土壤水浸液對香蕉枯萎病菌孢子萌發(fā)也表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌菌劑；香蕉枯萎??；香蕉；生物效應(yīng)

中圖分類號 S852.61 文獻標識碼 A

香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要水果和經(jīng)濟支柱，由古巴尖孢鐮刀菌（Fusarium. oxysporum f.sp.cubense）引起的香蕉枯萎病是香蕉生產(chǎn)上一種毀滅性的土傳病害。目前，對該病害的防治尚未發(fā)現(xiàn)較為理想的殺菌劑和抗病品種，而一些栽培管理措施也只能起到局部控制的效果[1]。生物防治具有安全環(huán)保、不殺傷天敵、不危害人畜、有利于生態(tài)平衡和穩(wěn)定等優(yōu)勢，在生產(chǎn)上對土傳病害具有較好的防治效果，是目前研究克服土傳病害的重要方法之一[2-5]，因此開展香蕉枯萎病的生物防治研究具有重要的意義。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有顯著的抗菌活性和極強的抗逆能力，對人畜無明顯毒害[6]。由于該菌在培養(yǎng)發(fā)酵過程中能形成抗逆性強的芽孢，因此制成的生防菌劑具有較長的貨架期，便于開發(fā)成商品。目前，國內(nèi)已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌商品制劑對水稻、大豆、棉花等農(nóng)作物上的重要病害均表現(xiàn)出較好的防治效果[7-8]。而試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對香蕉枯萎病具有良好的防效。Thangavelu R等[9]從香蕉根圍土壤中分離出的枯草芽孢桿菌對香蕉枯萎病菌菌絲生長具有顯著的抑制作用，防病效果可達41%。殷曉敏等[10]采用浸根處理的方法發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B215對香蕉枯萎病的盆栽防效為62.95%。牛春艷等[11]對香蕉的葉腋進行噴施生防菌，研究表明枯草芽孢桿菌TR21對香蕉枯萎病的田間防效可達61.92%。但在利用枯草芽孢桿菌菌劑進行香蕉枯萎病的生物防治以及其對香蕉生物效應(yīng)影響等方面的研究較少。張志紅等[12]將腐熟的有機肥與3種生防細菌組合成生物復(fù)混肥和生物有機肥，發(fā)現(xiàn)對香蕉枯萎病具有較好的防治效果，同時可引起土壤中的真菌數(shù)量明顯下降，放線菌數(shù)量明顯升高。

目前，本實驗室已篩選出1株對香蕉枯萎病菌具有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌T122F，前期的試驗發(fā)現(xiàn)該菌株能有效地定殖于香蕉體內(nèi)，研制出的枯草芽孢桿菌菌劑對香蕉枯萎病也表現(xiàn)出較好的防治效果。為了進一步明確該菌劑對香蕉枯萎病的生防機理，本試驗測定了T122F菌劑對香蕉生長、根際土壤微生物數(shù)量及其抑菌活性等生物效應(yīng)方面的影響，以期為該菌劑的合理施用以及香蕉枯萎病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

供試香蕉品種為臺蕉2號（Musa AAA），由福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學研究所生物中心提供；供試香蕉枯萎病生防菌劑為200億活芽孢/克枯草芽孢桿菌T122F可濕性粉劑、供試病原菌為香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f.sp.cubense race 4），均由福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供；香蕉枯萎病菌的培養(yǎng)采用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA），香蕉植株體內(nèi)細菌數(shù)量以及根際土壤細菌數(shù)量的測定采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）；SPAD-502PLUS便攜式葉綠素測定儀由廣州滬瑞明儀器有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌劑對香蕉苗生長的影響 將有4片葉的香蕉組培苗種植在直徑16 cm的黑色營養(yǎng)袋中，每袋1株。7 d后待香蕉苗恢復(fù)長勢時，采用灌根法，每株澆灌1 ∶ 300倍液的菌劑50 mL，每隔10 d澆灌1次，共3次，以澆灌清水為對照，每個處理10株，試驗設(shè)置3次重復(fù)。第3次施菌劑后20 d，調(diào)查香蕉苗展開的葉片數(shù)、測量株高，并采用葉綠素測定儀測量香蕉近基部第2葉的葉綠素含量。

1.2.2 菌劑對香蕉苗內(nèi)生細菌數(shù)量的影響 將有6片葉的香蕉組培苗種植在直徑16 cm黑色營養(yǎng)袋的滅菌土壤（121 ℃，2 h）中，每袋1株，每株澆灌1 ∶ 300倍液的菌劑100 mL，以澆灌清水為對照，每個處理15株。菌劑處理后10 d，隨機取香蕉苗3株，將香蕉根、球莖、葉分別合并后，參照楊秀娟[13]的方法，進行香蕉苗內(nèi)生細菌的分離，統(tǒng)計每皿菌落數(shù)，計算平均每毫克根、球莖和葉（鮮重）的含菌量。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 菌劑對香蕉苗離體葉片耐菌能力的影響

在1.2.1的方法基礎(chǔ)上，每個處理30株香蕉苗。菌劑處理后10 d，選擇長勢相當?shù)南憬督康?葉，用細針在葉片正面上方和下方葉脈左右兩側(cè)中間部位進行針刺處理，然后將處理好的葉片移到含1.2%水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中保濕，將菌齡一致的香蕉枯萎病菌菌塊（d=0.4 cm）貼置于香蕉葉片上方針刺位點和下方針刺位點處，有菌絲的一面朝下。培養(yǎng)皿用封口膜封好，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中（光 ∶ 暗=12 h ∶ 12 h，光強2 000 lx），4 d后采用十字交叉法測量葉片針刺點葉片組織損傷斑直徑，取其平均值比較處理間的差異。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 菌劑對大田香蕉植株生長及根際土壤細菌數(shù)量的影響 選擇土壤肥力一致，且前作香蕉枯萎病發(fā)病較均勻的蕉園種植香蕉苗，45 d后施菌劑稀釋液，每株2 L，之后每隔30 d施菌劑1次，每株2.5 L，共3次。菌劑稀釋液設(shè)置1 ∶ 100倍、1 ∶ 200倍和1 ∶ 300倍共3種處理，第3次施菌劑后20 d，調(diào)查各處理香蕉的長勢，測量株高、假莖粗和葉片葉綠素含量。同時在離香蕉基部30 cm處的東、南、西、北4個方位，各取其10 cm深處的根際土壤共約1 000 g，每株香蕉根際土壤在45 ℃下烘24 h后，研磨均勻，過篩，參照王占武[14]的方法測定根際土壤細菌的數(shù)量。每個處理共10株香蕉，以澆灌清水為對照，試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 菌劑對香蕉根際土壤抑菌活性的影響 在1.2.4的方法基礎(chǔ)上，將采集的香蕉根際土壤與無菌水按1 ∶ 10混勻后，上清液經(jīng)無菌雙層濾紙過濾后洗下PSA平板上香蕉枯萎病菌的分生孢子，制成孢子濃度為5×106 cfu/mL的懸浮液，在水瓊脂平板上將菌液涂勻，每株香蕉根際土壤重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)15 h后，在400倍鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，以萌發(fā)的芽管長度超過分生孢子短軸長視為萌發(fā)，每個處理觀察約300個孢子，重復(fù)3次。計算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。每個處理隨機取樣5株香蕉的根際土壤，以無菌劑處理的香蕉根際土壤水浸液洗下的分生孢子為對照。

孢子萌發(fā)率/%=（萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)）×100

孢子萌發(fā)抑制率/%=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和DPS 6.85軟件進行分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法分析不同處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑對香蕉苗生長的影響

在香蕉苗盆栽試驗中，菌劑300倍稀釋液處理能明顯促進香蕉苗生長，菌液處理的香蕉苗平均葉片數(shù)、株高和葉綠素分別為6.60片、18.20 cm和42.10 SPAD，分別比對照增加0.53片、4.27 cm和1.84 SPAD，與對照相比，差異均顯著（表1）。

2.2 菌劑對香蕉苗內(nèi)生細菌數(shù)量的影響

與對照相比，菌劑的施用能顯著提高香蕉苗根部、球莖部和葉部內(nèi)生細菌數(shù)量，其分離到的菌量分別為299.75×103、45.20×103、28.93×103 cfu/g FW，分別是對照的7.16、2.72、5.56倍（表2），其中以香蕉苗根部分離的內(nèi)生細菌數(shù)量最多，球莖部次之。

2.3 菌劑對香蕉苗離體葉片耐菌能力的影響

菌劑的施用能顯著提高香蕉苗離體葉片的耐菌能力，表現(xiàn)為葉片組織損傷斑直徑顯著小于清水處理的對照（表3），經(jīng)菌劑處理的香蕉葉片，其上方位點和下方位點的葉片組織損傷斑平均直徑分別為0.81 cm和0.74 cm，兩者之間差異不顯著。而空白對照的香蕉葉片，其上方位點和下方位點處理的葉片組織損傷斑平均直徑分別為1.09 cm和0.96 cm，兩者之間差異顯著。

2.4 菌劑對大田香蕉長勢的影響

在大田香蕉生長期間，施用菌劑能明顯提高香蕉植株的長勢，主要表現(xiàn)為株高、假莖周長和葉片葉綠素含量均明顯高于清水對照。其中以菌劑1 ∶ 100倍液處理的效果最好，其株高、假莖周長和葉片葉綠素含量與對照相比，差異均顯著（表4）。

2.5 菌劑對大田香蕉根際土壤細菌數(shù)量的影響

由表5可知，施用菌劑能明顯提高香蕉根際土壤的細菌數(shù)量，在菌劑稀釋100倍液、200倍液和300倍液的3種濃度中，從香蕉根際土壤分離到的菌量分別為58.08、51.70和49.50（106 cfu/g），分別是對照的2.59倍、2.30倍和2.20倍。差異顯著性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在菌劑施用的3種濃度中，其分離到的菌量差異不顯著。

2.6 菌劑對大田香蕉根際土壤抑菌活性的影響

菌劑的施用能顯著提高香蕉根際土壤的抑菌活性。與對照的土壤浸出液相比，菌劑處理的土壤浸出液能明顯抑制香蕉枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)。其中以菌劑1 ∶ 100倍液處理的土壤浸出液抑制孢子萌發(fā)效果最好，菌劑1 ∶ 200倍液處理的土壤浸出液抑制效果次之，但兩者間差異不顯著（表6）。

3 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌是一類廣泛分布于土壤、植物根際表面以及體內(nèi)等各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀好養(yǎng)型細菌，不僅能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，還能分泌類似植物生長素的代謝物，誘導(dǎo)植物內(nèi)源生長激素和葉綠素含量的增加，促進植物生長[15]。易有金等[16]采用盆栽試驗和內(nèi)源激素檢測等方法，發(fā)現(xiàn)施用內(nèi)生枯草芽孢桿菌B-001后，煙草幼苗的鮮重以及煙草體內(nèi)的吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷的含量增加，而脫落酸的含量降低。Fahin等[17]的研究也證實了枯草芽孢桿菌能分泌植物激素，對萵苣葉片生長有促生作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，施用枯草芽孢桿菌T122F菌劑后對香蕉生長有顯著的促進作用，推測枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的類似植物生長素的代謝物和菌劑中的某些營養(yǎng)物質(zhì)參與了香蕉的生長。

自然界中有很多細菌或真菌在接種進入土壤后能協(xié)調(diào)與周圍微生物的關(guān)系，營造不利于土傳病原菌生長的環(huán)境從而達到抑制植物病害發(fā)生的效果，當土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時，對抗病原菌的綜合能力就越強[18-20]。胡菊等[21]于2006年研究發(fā)現(xiàn)施用VT生物菌劑后，處理土壤中細菌、酵母菌和放線菌的數(shù)量增多，有效減少了病原菌的數(shù)量。Zhao等[22]則發(fā)現(xiàn)含有功能微生物枯草芽孢桿菌Y-IVI的生物有機肥（BIO）不僅對甜瓜枯萎病有很好的防治效果，且根際土壤中枯草芽孢桿菌Y-IVI的數(shù)量顯著高于對照。施用生物有機肥后寄主體內(nèi)抗菌脂肽類物質(zhì)和依枯草素A的含量也高于其他處理。本試驗研究發(fā)現(xiàn)施用枯草芽孢桿菌T122F菌劑能顯著增加香蕉苗根部、莖部和葉部內(nèi)生細菌以及大田植株根際土壤細菌的數(shù)量，提高香蕉苗離體葉片的抗菌能力和香蕉植株根際土壤的抑菌活性，試驗結(jié)果與前人報道的結(jié)果相符。后期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大田香蕉植株施菌液后其枯萎病的株發(fā)病率減少了70%以上，表明香蕉枯萎病的發(fā)生與植株體內(nèi)、根際土壤中細菌的數(shù)量以及土壤的抑菌作用可能存在著密切的關(guān)系。此外，枯草芽孢桿菌T122F能有效定殖于香蕉根、莖、葉中，推測香蕉內(nèi)生細菌種群數(shù)量的增加和葉片耐菌能力的提高與菌劑中枯草芽孢桿菌的定殖特性有一定的相關(guān)。

綜上所述，枯草芽孢桿菌菌劑不僅含有抗逆性強的芽孢，還含有菌體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抑菌代謝物及殘余的營養(yǎng)物質(zhì)。菌劑的施用不僅對香蕉本身具有促生作用，而且可增加植株體內(nèi)內(nèi)生細菌以及根際土壤細菌的數(shù)量，降低病原菌對根系的侵染，有利于土壤的生態(tài)系統(tǒng)朝著穩(wěn)定健康的方向發(fā)展。在當前因大量使用化學農(nóng)藥和復(fù)合肥防治植物病害造成對環(huán)境污染和人類健康危害的同時，利用安全、環(huán)境友好的生防菌劑于香蕉生產(chǎn)，對預(yù)防香蕉枯萎病的發(fā)生、蔓延與危害，保障香蕉種植業(yè)的健康發(fā)展具有良好的應(yīng)用前景。

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責任編輯：葉慶亮