采后荔枝果皮中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)與酶活分析

張建平 賈彩紅 王家保 徐碧玉

摘 要 為探明荔枝谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（LcGST）的表達(dá)與果皮褐變之間的關(guān)系，在荔枝cDNA芯片中獲得了荔枝LcGST全長cDNA序列（ABR15777）。該序列全長913 bp，5′-UTR長53 bp，3′-UTR長215 bp，含一個645 bp的完整開放閱讀框，編碼含214個氨基酸殘基的多肽。該氨基酸殘基序列與沙梨等物種的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白相似性較高?；虮磉_(dá)分析表明，LcGST在常溫儲存條件下基因的最大表達(dá)量出現(xiàn)在24 h，在保濕儲存條件下，LcGST的最大表達(dá)量出現(xiàn)在48 h。GST酶活性測定結(jié)果表明，在常溫儲存條件下酶活性的最大值出現(xiàn)在24 h，在保濕儲存條件下酶活性的最大值出現(xiàn)在48 h。說明LcGST在荔枝果皮褐化過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞 荔枝；胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因；表達(dá)；酶活

中圖分類號 S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果實(shí)采后會快速褐變，降低其商品價值[1]。荔枝采后果實(shí)迅速失水，果皮逐漸干裂，產(chǎn)生大量活性氧及自由基，這些活性氧及自由基導(dǎo)致膜脂過氧化的加速，同時荔枝果皮迅速褐變，因此，活性氧及自由基在荔枝采后果皮褐變過程中起著主要作用。有研究報(bào)道，植物體在受到脅迫后，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧及自由基，而為了防止活性氧類和自由基的損傷，植物體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase， GST）的含量會上升，催化清除植物體內(nèi)的自由基，使植物免受損傷[2]。

GST是一種多功能酶，主要用于催化三肽的谷胱甘肽與疏水的、親電的化合物發(fā)生親電取代反應(yīng)，而后通過選擇性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將連有谷胱甘肽的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡，達(dá)到消除毒素的作用[3]。GSTs二聚體由結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域II兩部分組成，兩者之間由5～10個氨基酸殘基組成的可變連接區(qū)連接。結(jié)構(gòu)域Ⅰ是還原型谷胱甘肽（GSH）的特異接合位點(diǎn)（G位點(diǎn)），由1組N-末端氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)域II是結(jié)合疏水性底物的位點(diǎn)（H位點(diǎn)），由C-末端氨基酸殘基組成[4]。GSTs最初是在20世紀(jì)60年代在動物體內(nèi)首先被發(fā)現(xiàn)的[5]，隨即70年代，人們在玉米中發(fā)現(xiàn)了第一個植物的GST酶，從此，便逐漸在所有的動植物以及細(xì)菌、真菌中都發(fā)現(xiàn)了與GSTs相對應(yīng)的酶或基因序列[5-6]。根據(jù)蛋白質(zhì)的序列相似性、底物專一性、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、動力學(xué)特征、空間結(jié)構(gòu)和是否能組成二聚體等特征，可以將植物GSTs基因家族分為8個類型，分別是Zeta、Theta、Tau、Phi、Lambda、DHAR（dehydroascorbate reductase）、TCHQD（etrachlorohydroquinone dehalogenase）和 EF1Bγ（the γ-subunit of the eukaryotictranslation elongation factor IB）[7]，其中Phi、Tau、Lambda和DHAR四類GSTs是植物所特有的[8]，Tau類和Phi類GSTs在植物中的分布最為廣泛，其中Phi類基因在植物的抗逆反應(yīng)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物抗病等方面都發(fā)揮著重要作用[8-10]。西紅柿中的GST能阻止其體內(nèi)的氧化傷害，抑制 Bax 蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[11]。這表明有些GST在穩(wěn)定細(xì)胞的氧化還原和調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性衰老方面起作用。

目前關(guān)于荔枝GST基因的研究報(bào)道較少，為進(jìn)一步研究GST基因在荔枝采后果皮衰老過程中的作用機(jī)理，本研究從cDNA芯片中獲得了荔枝GST基因全長LcGST，并分析其序列特征，研究在常溫儲存和保濕儲存條件下GST基因的表達(dá)情況，并測定在常溫儲存和保濕儲存條件下的酶活性，探討果皮褐變與GST基因表達(dá)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示果皮褐變機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 荔枝（妃子笑）采自華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)果園（海南省儋州市寶島新村）。選摘生長健康，沒有病害，沒有蟲害，成熟度基本一致（雌花授粉受精后約70～90 d）的果實(shí)為試驗(yàn)材料。

果實(shí)采后3 h運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，清水沖洗，自然晾干（約10 min左右），挑選大小基本一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)用作處理。第一組放置于（25±1）℃溫度下貯藏，環(huán)境空氣相對濕度（70±5）%培養(yǎng)箱中儲存（常溫儲存處理）；第二組用保鮮膜封閉包裝后同樣放置于（25±1）℃溫度下貯藏，環(huán)境空氣相對濕度（70±5）%培養(yǎng)箱中儲存（保濕儲存處理）。兩組材料在一定時間段的時候，剝下果皮，放入液氮中速凍，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 菌種E.coli DH5α由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存。cDNA合成試劑盒購自CLONTECH公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶購自上海申能博彩生物科技有限公司，引物合成委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，克隆載體試劑盒pMD20-T Vector購自TAKARA公司。其它生化試劑和常規(guī)試劑均為分析純或超純。

1.2 方法

1.2.1 荔枝果皮總RNA提取 荔枝果皮總RNA 的提取采用改良CTAB法的步驟進(jìn)行[12]。提取的總RNA根據(jù)Clonetech提供的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書，將10 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。

1.2.2 荔枝果皮GST基因的獲得 GST基因根據(jù)本課題組荔枝cDNA芯片測序獲得的，將該基因序列進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因?yàn)槿L序列。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，從cDNA中克隆GST基因的全長。GST基因的引物：5′端引物為：5′-ATGG

TGGTTAAAGTTTATGGAC；3′端引物為：CTAATAG

TAGGCAAGCTTCAT。PCR擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行：在每個0.2 mL離心管中加入4 μL dNTP，5 μL 10×Taq buffter， 0.5 μL Taq酶，2 μL 5′端引物，2 μL 3′端引物，1 μL單鏈cDNA及33.5 μL無菌雙蒸水，總體積50 μL。94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA回收試劑盒回收目的條帶，克隆到pMD20-T Vector載體上，序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 GST基因的RT-PCR半定量分析 根據(jù)GST基因和actin基因序列設(shè)計(jì)半定量PCR引物，每個基因片段大小在300 bp左右。GST基因5′端引物為：5′-CCTTTTGGGCAAGTTCCAGTAAT-3′；3′端引物為：5′-GCACCAACTTAACATCCTCCGTC-3′。actin基因5′端引物為：5′-ATCCTCCAATCCAG

ACACTGT-3′；3′端引物為：5′-CAGTGGTCGTACA

ACTGGTAT-3′。PCR擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行：在每個0.2 mL離心管中加入12.5 μL PCR-Mix緩沖液，1 μL 5′端引物，1 μL 3′端引物，1 μL單鏈cDNA及9.5 μL無菌雙蒸水，總體積25 μL。94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.4 GST酶活性測定 取-70 ℃冰箱中保存的不同處理時間點(diǎn)（0、24、48、72 h）的果皮作為材料，每個處理樣品隨機(jī)選30片果皮，在每片果皮上隨機(jī)切取一部分，把切取的各部分混合，作為1個處理的實(shí)驗(yàn)材料。所有處理重復(fù)3次。取上述處理的果皮，加入液氮和2% PVPP研磨，取大約1 g粉末轉(zhuǎn)入pH 7.8的50 mmol/L PBS緩沖液（含0.2 mmol/L EDTA和2 mmol/L的抗壞血酸），用冰冷卻。再12 000 g離心20 min，提取上清液用于測定酶的活性。酶活測定用1.5 mL反應(yīng)液，1.5 mL反應(yīng)體系中含：1.5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0），75 μL 100 mmol/L的GSH，15 μL GST待測液，然后加入75 μL 100 mmol/L的CDNB啟動反應(yīng)，以不加CDNB的空白管為對照，測定OD340的變化。酶活單位：每分鐘催化1 μmol CDNB結(jié)合GSH的酶量為1個單位（1 U）[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcGST的序列分析

利用NCBI軟件對LcGST進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)荔枝果皮GST基因cDNA全長933 bp（GenBank登錄號為ABR15777），包含一個645 bp的完整開放讀碼框，編碼214個氨基酸多肽，5′（5′UTR）端含有一個53 bp的非編碼區(qū)序列，3′（3′UTR）端含有一個235 bp的非編碼區(qū)序列（圖1）。該基因編碼蛋白由結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域II兩部分組成，結(jié)構(gòu)域I是谷胱甘肽（GSH）特異性結(jié)合位點(diǎn)（G位點(diǎn)，圖1中紅色框），結(jié)構(gòu)域II是疏水底物的結(jié)合位點(diǎn)（H位點(diǎn)，圖1中藍(lán)色框），符合GST基因的特征（圖1），因此將其命名為LcGST。

Blastx比對結(jié)果表明，該基因推導(dǎo)的氨基酸殘基序列與沙梨、可可、苜蓿、葡萄和毛果楊蛋白序列相似性分別為72%、69%、68%、68%和67%，并且與他們的序列聚為一支（圖2）。

2.2 LcGST在常溫儲存和保濕儲存條件下的表達(dá)分析

利用半定量PCR對LcGST在常溫儲存條件下荔枝果皮中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從圖3中可以看出，常溫處理的荔枝果皮LcGST相對表達(dá)量是先上升后下降的過程，在0～24 h之間是上升的過程，隨后表達(dá)量下降。

此外對LcGST在保濕處理?xiàng)l件下荔枝果皮中的表達(dá)進(jìn)行了分析，從圖4中看出在保濕處理的條件下，荔枝果皮LcGST相對表達(dá)量在0～48 h之間其表達(dá)量逐漸升高，在48 h達(dá)到最高峰，接著降低。

2.3 GST酶活性的測定

對常溫儲存和保濕儲存處理后荔枝果皮中GST酶的活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，常溫儲藏條件下GST酶活性在24 h迅速升高，酶活性達(dá)到一個峰值，隨后逐漸下降。保濕儲藏條件下GST酶活性沒有明顯的變化（圖5）。

3 討論

本研究在cDNA芯片的基礎(chǔ)上獲得了荔枝谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶LcGST的全長cDNA 序列（ABR15777），該序列推導(dǎo)的氨基酸殘基具谷胱甘肽（GSH）特異性結(jié)合位點(diǎn)（G位點(diǎn)）和疏水底物的結(jié)合位點(diǎn)（H位點(diǎn)），符合GST酶的特征。Blastx比對分析該氨基酸序列與沙梨的氨基酸序列一致性達(dá)72%。經(jīng)過ExPASy網(wǎng)站ProtParam工具分析，LcGST基因編碼的蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為5.31，分子量為24.49 kD。

有研究結(jié)果表明，果皮褐變與果實(shí)失水有關(guān)[14-15]。果實(shí)失水主要發(fā)生在果皮[16-17]。隨果皮失水量增加，果皮褐變指數(shù)升高[16-20]，二者呈明顯正相關(guān)[16]。隨果皮失水量增加，果皮pH升高，高濕貯藏環(huán)境下果皮含水量高，pH上升較慢[16-17]，果皮褐化現(xiàn)象也較慢。這些結(jié)果說明果皮失水是導(dǎo)致果皮褐變的主要原因之一[21]。GST提供的過氧化物清除能力的提高在防止植物遭受脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷過程中可能是一個關(guān)鍵因子[22]。本研究對GST基因在常溫儲存和保濕儲存下荔枝果皮中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在常溫儲存條件下，GST基因在24 h時表達(dá)量最大，而此時也是荔枝果皮開始褐化的時間；在保濕儲存的條件下，GST基因表達(dá)量的最大值出現(xiàn)在48 h，這在基因表達(dá)水平上初步說明了荔枝果皮褐變與GST基因有關(guān)。同時對GST酶的活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明在常溫儲存的條件下，荔枝在采后24 h內(nèi)開始褐變的同時[21]，GST的酶活性達(dá)到一個峰值，此時荔枝的褐變指數(shù)也緩慢增加[23]，這初步說明在常溫儲存條件下，果皮失水、氧化嚴(yán)重，為了防止果皮褐化，防止活性氧類的損傷，荔枝果皮內(nèi)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）的含量上升，從而催化清除果皮體內(nèi)的自由基組織以防止果皮褐化。在后期荔枝果皮嚴(yán)重褐變則主要是由于酚類物質(zhì)的酶促或非酶促反應(yīng)生成黑色物質(zhì)的累積所致[17]，而不受果皮內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的影響，所以后期GST酶的活性下降。在保濕儲存的條件下，荔枝果皮的褐化程度較慢，在儲存前3天荔枝果皮基本沒有褐化，荔枝果皮中的自由基含量很少，不需要GST酶清除果皮中的自由基，所以GST酶的活性一直保持較低的水平。這從生理學(xué)水平上也初步說明荔枝褐化與GST酶的活性相關(guān)。

綜上所述，GST基因的表達(dá)與酶活變化趨勢相吻合，說明在荔枝果皮褐化過程中GST酶在其過程中起作用，但GST酶在果皮褐變過程中具體起什么作用，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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責(zé)任編輯：趙軍明