二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表達(dá)分析

顏彥 胡偉

摘 要 從二穗短柄草中擴(kuò)增得到一個2C型蛋白磷酸酶基因，命名為BdPP2C1。BdPP2C1與擬南芥中PP2C家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，BdPP2C1與擬南芥A類PP2C家族成員的親緣關(guān)系較近。利用實(shí)時熒光定量PCR表達(dá)分析系統(tǒng)，分析在非生物逆境脅迫及相關(guān)信號分子處理下BdPP2C1基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：該基因的表達(dá)受脫落酸（ABA）和雙氧水抑制，并且受滲透和低溫脅迫誘導(dǎo)。因此，BdPP2C1是非生物逆境脅迫中的一個應(yīng)答因子，并且可能受相關(guān)信號分子調(diào)控。

關(guān)鍵詞 短柄草；PP2C；克??；表達(dá)

中圖分類號 Q344 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化不僅是生物體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的重要途徑，而且也在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。此前的研究熱點(diǎn)主要集中在蛋白激酶上[1-4]，但近幾年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白磷酸酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起著非常重要的調(diào)控作用，尤其體現(xiàn)在植物對高鹽、干旱及低溫等環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[5]。2C型蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase 2C， PP2C）是蛋白磷酸酶中的一大類，它廣泛地參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡信號調(diào)控、支鏈氨基酸的代謝、植物的生長發(fā)育及環(huán)境脅迫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。PP2C通過催化去磷酸化作用負(fù)調(diào)控蛋白激酶級聯(lián)信號系統(tǒng)。H2O2、不飽和脂肪酸、Ca2+/CaM、脂質(zhì)信號分子等均可調(diào)節(jié) PP2C的活性[6]。目前，已從多個物種中鑒定出了PP2C家族基因，其中人類基因組中有15個，線蟲中有8個，果蠅中有10個，酵母菌中僅有7個，而在擬南芥中發(fā)掘出80個[7-8]，在水稻中鑒定出了78個PP2C家族的基因[3]，但其中絕大部分基因的功能還未得到深入的研究[9-10]。

二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）與黑麥草（Lolium perenne L.）、 小麥（Triticum aestivum L.）、 大麥（Hordeum vulgare L.）和燕麥（Avena sativa L.）等同屬于早熟禾亞科，基因組序列與這些作物高度相似[11-13]。二穗短柄草具有植株個體小、生長周期短、自花受精、易被轉(zhuǎn)化、基因組小（約355 Mb）及存在不同倍性的基因組等特點(diǎn)，所以，二穗短柄草被麥類、牧草及能源植物研究者推選為研究溫帶禾本類植物的模式植物。二穗短柄草全基因組序列測定的完成，為其在基因組水平上的研究提供了便利[14]。然而，二穗短柄草中PP2C基因的研究尚未見報道。

本研究對二穗短柄草BdPP2C1基因進(jìn)行克隆、序列分析、進(jìn)化關(guān)系分析，并對其在逆境脅迫及多種信號分子處理下的表達(dá)模式進(jìn)行研究。結(jié)果表明BdPP2C1基因可能參與逆境脅迫及相關(guān)信號分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因的方法鑒定BdPP2C1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 二穗短柄草種子由本實(shí)驗室保存。將二穗短柄草種子播種在花盆中（營養(yǎng)土和蛭石比例為3 ∶ 1），生長6周后，取其葉片進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析。

1.1.2 主要試劑 PEG6000、NaCl、脫落酸（ABA）等生化試劑購自上海生工生物工程有限公司，RNA提取試劑盒購自天根生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，PCR試劑購自康為世紀(jì)生物公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 根據(jù)二穗短柄草數(shù)據(jù)庫中的序列信息（www.phytozome.org）設(shè)計1對引物（P1：ATGGCGGAGATTTGCAGCG；P2：TCACGGC

CTCGGGCGGCGC）。利用6周大的短柄草葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增該基因開放閱讀框（ORF）全長；PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收擴(kuò)增片段；將回收的片段利用T4DNA連接酶連接到PMD18-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10；挑單菌落進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定；將鑒定的陽性克隆進(jìn)行測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對和結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用ORFFinder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和GENSCAN（http：//genes.mit.edu/GEN

SCAN.html）進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測，利用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.3 BdPP2C1基因的表達(dá)分析 6周大的短柄草幼苗用20% PEG6000、100 mmol/L NaCl、4 ℃低溫、100 μmol/L ABA、100 μmol/L乙烯、10 mmol/L H2O2分別處理0、1、3、6、12、24 h，提取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA第一鏈為模板。為避免基因組DNA的污染，在RNA的提取過程中進(jìn)行了基因組DNA的消化。實(shí)時熒光定量PCR采用TaRaKa公司的試劑盒，染料為SYBR Green，在吉泰生物科技有限公司Mx 3005P熒光定量PCR儀上進(jìn)行。以短柄草Actin基因為內(nèi)參。定量方法為2-ΔΔCt法：ΔΔCt=（CT， Target-CT， Actin）Time x-（CT， Target-CT， Actin）Time 0[15]。擴(kuò)增所用引物的序列分別為：P3（BdPP2C1）：AACTGTCGCCTGCTGTTTCG；P4（BdPP2C1）：CTTCCTGGACGCCTCCTCAT；P5（BdActin）CCCGATGGACAGGTTATCACTA；P6（BdActin）

ATAGAGCCACCAATCCAAACAC。引物設(shè)計參考TaKaRa實(shí)時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)說明書。為了保證引物的特異性，引物設(shè)計在UTR區(qū)域，PCR產(chǎn)物的長度維持在300 bp以內(nèi)。用于實(shí)時熒光定量PCR的引物均由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR的反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性7 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆及序列分析

從二穗短柄草數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)1個1 218 bp的cDNA序列，通過ORF Finder和GENACAN軟件分析結(jié)果表明，該cDNA序列有1個翻譯起始密碼子ATG，相同讀碼框內(nèi)有1個終止密碼子TGA，表明此序列是一個全長基因（圖1）。該基因開放閱讀框（ORF）編碼405個氨基酸。隨后，根據(jù)該cDNA序列設(shè)計2條引物，從PEG6000滲透處理6 h的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈模板中克隆了該基因全長。測序分析結(jié)果表明，所克隆的cDNA序列與數(shù)據(jù)庫中的序列有99%的一致性，將其命名為BdPP2C1。BLASTX分析結(jié)果表明，BdPP2C1 cDNA與粗山羊草（EMT07491.1）、狗尾草（XP_004984925.1）、小麥（EMS59347.1）PP2C家族基因有較高的一致性，分別為82%、81%、78%。利用MEGA軟件，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中包括80個擬南芥PP2C家族成員（圖2）。這些PP2C家族成員包含了A-L類PP2C。從進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，短柄草BdPP2C1與AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上，與AtPP2C78親緣關(guān)系最近。上述結(jié)果表明本研究所克隆的cDNA序列為短柄草PP2C家族基因。

2.2 BdPP2C1基因在信號分子處理下的表達(dá)分析

在乙烯處理條件下，BdPP2C1基因的表達(dá)沒有顯著變化（圖3-B）；在ABA處理條件下，該基因的表達(dá)在處理1 h被誘導(dǎo)，在處理3、6、12、24 h被抑制，在處理24 h達(dá)到最小值（圖3-A）；在H2O2水處理條件下，處理1、3、6、12、24 h，BdPP2C1基因的表達(dá)均顯著被抑制（圖3-C）。上述結(jié)果表明，BdPP2C1能夠被逆境脅迫相關(guān)的信號分子ABA和雙氧水調(diào)控。

2.3 BdPP2C1基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析

在NaCl處理條件下，BdPP2C1基因的表達(dá)沒有顯著變化（圖4-A）；在PEG6000處理條件下，處理1、3、6、12、24 h，該基因的表達(dá)均能被顯著誘導(dǎo)，并表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在處理6 h達(dá)到最大值（圖4-B）；在低溫處理條件下，處理3、6、12、24 h，該基因的表達(dá)能被顯著誘導(dǎo)，并表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，在處理24 h達(dá)到最大值（圖4-C）。上述結(jié)果表明，BdPP2C1基因能夠參與逆境脅迫，顯著受滲透和低溫脅迫誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

在低溫、干旱、高鹽等逆境脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)進(jìn)而引起一系列的生理生化變化，以適應(yīng)環(huán)境的多變性。已有研究證實(shí)植物體內(nèi)存在依賴ABA和不依賴ABA這2種信號途徑來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)以應(yīng)對脅迫環(huán)境[16-17]。ABA作為一種關(guān)鍵的植物激素，在逆境脅迫尤其是在干旱和高鹽的環(huán)境下發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在ABA信號途徑中起著非常重要的作用。高等植物中PP2C廣泛參與依賴ABA的多種生理過程，包括ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)、氣孔關(guān)閉、幼苗根系的伸長、抗病原菌侵害、生長發(fā)育及逆境脅迫等。

近年來，ABA信號途徑的研究取得了較大的進(jìn)展。在擬南芥中已經(jīng)建立了較為完善的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中存在3個組分：PYR/PYL/RCAR（ABA受體）、 PP2C（負(fù)調(diào)控因子）、SnRK2（正調(diào)控因子）。這3個組分形成一種雙負(fù)調(diào)控系統(tǒng)：在沒有ABA存在的時候，PP2C通過直接地去磷酸化的方式抑制SnRK2；在有ABA存在的時候，ABA與受體PYR/PYL/RCAR結(jié)合，促進(jìn)了PYR/PYL/RCAR與PP2C的相互作用，從而抑制PP2C并激活SnRK2[18]。因此，PP2C在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用。在環(huán)境脅迫發(fā)生時，植物為了應(yīng)對環(huán)境脅迫開啟了多種信號通路，包括ABA信號通路。因此，PP2C也通過ABA信號途徑在植物應(yīng)答環(huán)境脅迫過程中起著重要作用。

植物中對于PP2C的報道主要集中在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，Schweighofer等[5]報道了擬南芥中76個PP2C基因，并將它們分成10個組；Xue等[8]利用生物信息手段從擬南芥和水稻基因組中分別分離出80和78個PP2C，并分別將它們分為13和11個組。本研究擴(kuò)增得到的BdPP2C1基因ORF為1 218 bp，編碼405個氨基酸。序列分析結(jié)果表明，BdPP2C1與其他物種中PP2C基因具有較高的一致性。進(jìn)化分析結(jié)果表明，BdPP2C1與擬南芥AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上。這些擬南芥PP2C基因都屬于A類PP2C家族基因[8]，因此，本研究所克隆的BdPP2C1是一個A類二穗短柄草PP2C基因。

先前的研究結(jié)果表明，擬南芥A類PP2C能夠在轉(zhuǎn)錄水平被ABA誘導(dǎo)[8]，而擬南芥A類PP2C酶活力在翻譯后水平被抑制，從而作為負(fù)調(diào)控因子參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。本研究中，BdPP2C1的表達(dá)在ABA處理1 h被誘導(dǎo)，而在ABA處理3～24 h被抑制。這些結(jié)果暗示著BdPP2C1的表達(dá)在處理早期響應(yīng)ABA刺激上調(diào)表達(dá)，但隨著處理時間的延長，為了促進(jìn)其酶活被抑制而在轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出被ABA抑制。因此，BdPP2C1可能是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子。植物體內(nèi)ABA的積累會誘導(dǎo)雙氧水的產(chǎn)生，雙氧水也作為一種信號分子參與多種生理過程。本研究結(jié)果也表明雙氧水能抑制BdPP2C1的表達(dá)。這一結(jié)果暗示著ABA介導(dǎo)的雙氧水的產(chǎn)生也可能是調(diào)控BdPP2C1的一種方式。

逆境脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)的代謝水平發(fā)生顯著變化，一些信號分子會顯著積累，如ABA、乙烯、雙氧水。這些信號分子在調(diào)控植物對逆境脅迫的適應(yīng)過程中起著至關(guān)重要的作用。BdPP2C1能夠受到信號分子調(diào)控暗示著該基因也可能參與植物對逆境脅迫的應(yīng)答。本研究結(jié)果表明，BdPP2C1的表達(dá)在PEG處理下表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但總體上能夠被PEG誘導(dǎo)，在處理6 h達(dá)到最大值。這一結(jié)果暗示著BdPP2C1能夠快速響應(yīng)滲透脅迫，并達(dá)到最大值，隨后表達(dá)水平降低。植物對逆境脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)存在對信號的激活放大與失活關(guān)閉[5]。BdPP2C1對滲透脅迫應(yīng)答的趨勢符合植物對逆境脅迫應(yīng)答的基本模式。另外，BdPP2C1的表達(dá)對低溫脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，表明BdPP2C1對低溫脅迫的應(yīng)答較為緩慢。雖然PP2C是ABA信號途徑的負(fù)調(diào)控因子，但PP2C參與逆境脅迫表現(xiàn)出較為復(fù)雜的模式。過表達(dá)山毛櫸PP2C2降低了擬南芥對非生物逆境脅迫的耐受性[19]。然而，擬南芥PP2CG1和玉米PP2C2被報道能夠正調(diào)控植物對高鹽和低溫脅迫的耐受性[20-21]。上述結(jié)果表明，PP2C可能作為正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控因子參與非生物逆境脅迫，其原因可能是PP2C能夠通過多種信號途徑參與植物對非生物逆境脅迫的應(yīng)答。

短柄草是一種新型的模式植物，開展短柄草基因結(jié)構(gòu)和功能的研究能夠促進(jìn)禾谷類糧食作物的遺傳改良[22]。對短柄草PP2C家族的BdPP2C1基因功能的深入研究，將有助于理解植物對逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)制。在隨后的研究工作中，將利用RNAi或過量表達(dá)的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系，通過表型分析、生理學(xué)分析、調(diào)控途徑分析闡明BdPP2C1在逆境脅迫中的功能及作用機(jī)制。

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責(zé)任編輯：黃東杰