定性PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810轉(zhuǎn)化事件的研究

易小平 賀萍萍 夏啟玉 肖蘇生 謝翔 楊小亮 李美英 郭安平

摘 要 轉(zhuǎn)基因玉米MON810（YieldGardR）是孟山都公司通過DNA重組技術和微注射轟擊研發(fā)的一種具有對歐洲玉米螟（ECB；Ostrinia nublialis）有特殊抗性的轉(zhuǎn)基因玉米品系，目前在世界各地已經(jīng)得到廣泛種植，為加強對該品系玉米的安全管理，本研究旨在建立MON810品系玉米的轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法。根據(jù)MON810的插入序列信息，在3′端的側(cè)翼序列處設計定性PCR檢測的引物，檢測MON810在其他幾種常見轉(zhuǎn)基因作物混合樣品的特異性。結(jié)果表明，該方法具有很好的特異性。同時檢測該引物系統(tǒng)的擴增靈敏度，結(jié)果表明，檢測引物的靈敏度可達0.1%。建立的MON810特異定性PCR檢測方法經(jīng)全國7家實驗室的驗證，進一步證實該方法能夠特異地檢測出樣品中的MON810轉(zhuǎn)化事件，檢測方法的靈敏度可達0.1%，且檢測結(jié)果具有良好的可重復性和可重現(xiàn)性。MON810轉(zhuǎn)化事件定性PCR檢測方法的建立可滿足于抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種生物安全管理的需要。

關鍵詞 轉(zhuǎn)基因玉米MON810；定性PCR；靈敏度；特異性

中圖分類號 S19 文獻標識碼 A

玉米是大宗糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，由于蟲害的威脅，導致其產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重下降。其中玉米螟是世界性的主要玉米害蟲，每年因玉米螟危害造成玉米產(chǎn)量損失在5%左右。中國是玉米螟的多發(fā)和重發(fā)區(qū)，20世紀70年代以來，幾乎每2 a就大發(fā)生1次，年損失玉米380～640萬t，相當于一個中等省玉米的產(chǎn)量。而MON810（YieldGardR）玉米是孟山都公司研發(fā)的一種具有對歐洲玉米螟（ECB；Ostrinia nublialis）有特殊抗性的轉(zhuǎn)基因玉米品系，能保護玉米免受歐洲玉米螟ECB幼蟲對莖葉的損害。因此MON810玉米自1996年在美國得到批準商業(yè)化種植以來，相繼在歐洲、加拿大、阿根廷、澳大利亞、日本等多個國家和地區(qū)受到種植業(yè)主的歡迎[1-2]。2005年后，中國允許進口MON810玉米用于加工飼料。MON810玉米的研發(fā)給人們帶來很大的收益和便利，但是其安全性問題目前仍存在著很大的爭議[3-6]，MON810玉米的種植曾在法國和德國得到禁止[3]。因此為加強MON810玉米的安全管理，對MON810玉米品系的特異性檢測研究也具有重要的現(xiàn)實意義。

目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要分為2類，一類是基于核酸水平的檢測方法（如定性和定量PCR方法），另一類是基于蛋白的檢測方法（如ELSA方法）。定性PCR方法具有高特異性，較高的檢測靈敏度，檢測的成本較低，因而是目前轉(zhuǎn)基因成分檢測最常用的方法[7-8]。MON810玉米自商品化種植以來，MON810玉米的轉(zhuǎn)基因成分檢測也備受關注。2003年，曹際娟[1]首先利用篩選檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的CaMV35S啟動子檢測到了195 bp的擴增產(chǎn)物，又在質(zhì)粒載體插入玉米基因組的5′的側(cè)翼序列設計了1對MON810轉(zhuǎn)化體特異性檢測引物，其中上游引物在玉米的基因組位置，下游引物在CaMV35S啟動子位置，擴增片段大小為170 bp。近年來，環(huán)介導的等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）在MON810玉米轉(zhuǎn)化事件的檢測中也得到探討[9]。目前有關MON810檢測的熒光定量PCR方法也有很多報道[10-11]。但熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因成分的成本較高，不能得到普遍應用。基于以上分析，MON810轉(zhuǎn)化事件定性PCR檢測方法的研究更具有實際應用意義。Moon等[12]建立了特異擴增MON810 轉(zhuǎn)化事件的80 bp的新的定性PCR的引物系統(tǒng)。農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007有關MON810 轉(zhuǎn)化事件的檢測標準的擴增產(chǎn)物為106 bp[13]，這些檢測方法擴增片段太小，不易與引物二聚體分開，并且還有明顯的非特異性擴增現(xiàn)象，在對MON810轉(zhuǎn)基因成分的判定時容易誤判。

為了更好地防止轉(zhuǎn)基因玉米MON810的流轉(zhuǎn)散失，本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MON810的3′端側(cè)翼序列，建立了新的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法，為轉(zhuǎn)基因玉米MON810的生物安全管理提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品的制備

轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays）MON810及其受體由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供。將MON810玉米與對應的非轉(zhuǎn)基因玉米按質(zhì)量比混合，制成MON810質(zhì)量分數(shù)分別為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%的樣品。含有MON810玉米的轉(zhuǎn)基因玉米混合物、不含有MON810玉米的轉(zhuǎn)基因玉米混合物、轉(zhuǎn)基因大豆混合物、轉(zhuǎn)基因水稻混合物、轉(zhuǎn)基因棉花混合物和轉(zhuǎn)基因油菜混合物等轉(zhuǎn)基因試驗材料的混合樣品由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心委托農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（長春）制備（每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量百分含量為1%），具體轉(zhuǎn)化體組分見表1。非轉(zhuǎn)基因玉米（陰性對照）由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因玉米MON810外源基因插入位點旁側(cè)序列的獲得及其引物設計 在GMO檢測方法數(shù)據(jù)庫（Detection method Database，GMDD）（http：//gmdd.shgmo.org/sequence/view/12）中查到MON810的旁側(cè)序列信息，在其3′端旁側(cè)的cry1Ab序列部分設計上游引物MON810-F：5′-ACCTCGAGATTTAC

CTGATCCG-3′，在玉米基因組的位置設計下游引物MON810-R：5′-TGCTGCAGGTGGTCTTACATC-3′。

1.2.2 特異性測試 特異性測試樣品見表1。以質(zhì)量百分含量為1%的MON810玉米為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因玉米為陰性對照，同時設置空白對照。樣品基因組DNA的抽提采用CTAB方法[14]，提取的DNA用NanoDrop2000C（Thermo scientific）型核酸測定儀檢測DNA的濃度和純度，DNA濃度調(diào)整到25 ng/μL后用于PCR檢測[14]。PCR 反應體系為10×Buffer 5.0 μL， dNTPs（10 mmol/L each）0.5 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，上下游引物終濃度為0.4 μmol/L， 模板2.0 μL，總體積為25 μL；PCR擴增程序為： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 共35個循環(huán)；3次平行重復。

1.2.3 靈敏度測試 以質(zhì)量分數(shù)分別為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%的MON810樣品的DNA作為PCR反應的模板，進行靈敏度測試，非轉(zhuǎn)基因玉米為陰性對照，同時設置空白對照。樣品基因組DNA的抽提、PCR反應體系和PCR擴增程序與1.2.2相同。

1.2.4 檢出限的確定 為進一步確定方法的檢出限，隨機稱取20份質(zhì)量分數(shù)為0.1%的MON810玉米樣品，提取基因組DNA，進行PCR擴增，每個樣品設置3次平行PCR反應。非轉(zhuǎn)基因玉米為陰性對照，同時設置空白對照。樣品基因組DNA的抽提、PCR 反應體系和PCR擴增程序與1.2.2相同。

1.2.5 重演性驗證 為驗證建立抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法的重演性，在全國7家同行實驗室對方法的檢測特異性和靈敏度進行了測試。包括農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物用微生物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（北京）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（北京）、農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）、農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（杭州）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（天津）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（天津）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（長春）7家單位。驗證樣品如下：a：以質(zhì)量分數(shù)為0.1%（以非轉(zhuǎn)基因玉米為填充物）的MON810作為陽性對照；b：MON810玉米的受體作為陰性對照；c：特異性測試樣品包括10個樣品，包括以質(zhì)量分數(shù)為1%的MON810玉米、質(zhì)量分數(shù)為1%的Bt11玉米、質(zhì)量分數(shù)為1% Bt176玉米、質(zhì)量分數(shù)為1%的DAS-40278-9玉米、轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品（MON863、 GA21、 NK603、 T25、 TC1507、 MON89034、 MON88017、 59122、 MIR604、 3272、 MON87460，混合制成1個樣品，每個轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)為1%）、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12，混合制成1個樣品，每個轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)為1%）、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品（KF-6、KMD-1、M12、KF-8，混合制成一個樣品，每個轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)為1%）、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品（MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2，混合制成1個樣品，每個轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)為1%）、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913，混合制成1個樣品，每個轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分數(shù)為1%）、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958、吉單180、先玉335，等量混合制成1個樣品；d：質(zhì)量分數(shù)為0.1%的 MON810玉米作為靈敏度測試樣品；e：以MON810玉米質(zhì)量分數(shù)為5%的玉米面加工制作并蒸熟后的玉米饅頭制成1個樣品為加工樣品的測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米MON810外源基因插入位點旁側(cè)序列分析

由圖1可知，MON810分子信息顯示表達載體的部分元件整合到玉米的基因組序列中，包括強啟動子CaMV35S、玉米hsp70 內(nèi)含子和cry1Ab；5′端上游部分有803 bp的玉米基因組序列，3′下游部分有588 bp的玉米基因組序列，全長為4 983 bp；并且在插入序列及其3′端的玉米基因組序列設計了定性PCR檢測MON810玉米的上下游引物。

2.2 特異性測試

由圖2可知，僅從MON810玉米和含有MON810的轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品中擴增到預期的DNA條帶，而在其他轉(zhuǎn)基因玉米（Bt176、Bt11、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON88017、MON87460）、大豆（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2）、水稻（KF-6、KMD-1、M12、KF-8）、油菜（MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2）、棉花（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913）混合樣品中和非轉(zhuǎn)基因玉米陰性對照樣品中未擴增出預期條帶的片段，上述結(jié)果表明建立的MON810玉米檢測方法具有高度特異性。

2.3 靈敏度測試

由圖3可知，在含量為0.1%以上（含0.1%）的MON810樣品中均能穩(wěn)定擴增到預期的DNA片段，表明建立的MON810玉米檢測方法的靈敏度可達到0.1%。

2.4 檢出限的確定

由圖4可知，20份含量為0.1%的MON810試樣中均能穩(wěn)定檢測出預期的DNA片段，表明本方法的檢出限為0.1%。

2.5 重演性的驗證結(jié)果

7家單位包括農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物用微生物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（北京）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（北京）、農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）、農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（杭州）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（天津）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（天津）、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（長春）（在表2 中分別用1～7數(shù)字表示）的復核驗證結(jié)果見表2，僅從含有MON810轉(zhuǎn)化體的樣品（含加工品）中擴增獲得預期的DNA片段，而在其他轉(zhuǎn)基因玉米（Bt11、Bt176、DAS-40278-9、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460）、轉(zhuǎn)基因大豆（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12）、轉(zhuǎn)基因水稻（KF-6、KMD-1、M12、KF-8）、轉(zhuǎn)基因油菜（MS1、 MS8、 RF1、 RF2、 RF3、 T45、 Oxy235、Topas19/2）、轉(zhuǎn)基因棉花（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913）和非轉(zhuǎn)基因玉米陰性對照樣品中未擴增獲得預期片段。所有驗證單位從含量為0.1%的MON810玉米樣品中擴增獲得預期片段，再次證明檢測方法的靈敏度可達到0.1%，在加工品測試中，可從MON810玉米加工品饅頭中擴增獲得預期片段。

2.6 新方法與農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007比較

新方法與農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007相比見表3，引物設計的位置不同，新建立的方法引物設計的擴增區(qū)域為4 216～4 541 bp，擴增大小為325 bp，農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007的引物設計的擴增區(qū)域為4 315～4 421 bp，擴增大小為106 bp，因而新建立的檢測方法具有較好的特異性，不存在非特異性擴增現(xiàn)象。在同等實驗條件下，不能檢測出其他常見的轉(zhuǎn)基因作物（包括轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花和油菜），不會誤判，不會引起爭議。

3 討論與結(jié)論

目前，轉(zhuǎn)基因生物的安全性已經(jīng)成為公眾媒體輿論的焦點。為防范農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的流散，農(nóng)業(yè)部一再強調(diào)對轉(zhuǎn)基因作物實施嚴格管理。孟山都公司研發(fā)的抗蟲MON810玉米，由于能對抗玉米螟，因而受到廣大種植戶的歡迎。但MON810玉米的安全性一直是科學家及民眾爭論的焦點[3-6]。MON810玉米是獲準進口到中國用作加工原料較早的一種轉(zhuǎn)基因玉米品系。它在進口、加工或銷售過程中可能存在流散，所以應該加強對該品系玉米的監(jiān)管。建立MON810玉米品系特異性的檢測方法和標準是對其監(jiān)管的前提基礎。

MON810自研發(fā)到應用以來，對MON810玉米品系特異性檢測方法的研究一直沒有停止，歐盟也已經(jīng)建立了定量PCR檢測方法，并且在幾個實驗室間已進行循環(huán)驗證[15]。環(huán)介導的等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）也對MON810轉(zhuǎn)化事件檢測進行了報道。實時熒光定量PCR檢測技術是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分含量進行標示的前提基礎，而且這種檢測技術成本較高，所需要的熒光定量PCR儀器設備并非所有的基層單位所能擁有，不適用于大規(guī)模的篩選檢測。環(huán)介導的等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）是一種新興技術，要發(fā)展為成熟常規(guī)的轉(zhuǎn)基因成分檢測的適用技術還需要很長時間。因此，目前定性PCR技術還是比較適用于轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的技術之一。

本研究建立的MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法與曹際娟[1]相比，引物設計的位置不同，新建立的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法的上游設計在抗蟲基因cry1Ab序列上，下游引物設計在玉米的基因組序列，而曹際娟[1]的研究方法是上游引物設計在玉米基因組序列，下游引物在CaMV35S啟動子的序列。這種方法也是目前檢測MON810玉米轉(zhuǎn)化體特異性的一種常用方法。新建立的方法擴增片段序列為抗蟲基因cry1Ab部分序列與玉米基因組的部分序列，這種方法具有更好的特異性，對于抗蟲玉米MON810的檢測更具有針對性。與農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007相比，新建立的方法引物設計區(qū)域有差異，擴增大小不同，新方法的擴增大小為325 bp，農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007擴增大小為106 bp，因而新建立的檢測方法具有較好的特異性，不存在非特異性擴增現(xiàn)象。同時，本研究建立的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法具有良好的靈敏性，檢出限達到0.1%，能夠滿足大宗混合樣品檢測的需要，這種方法也適用于對加工樣品的測試。綜上所述，本研究建立的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法的特異性、靈敏度和重復性經(jīng)過了全國7家同行實驗室的驗證。這是建立抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種的定性PCR檢測方法的標準基礎。利用該方法能準確鑒定出利用MON810作為親本非法轉(zhuǎn)育出的衍生品種，從而可防止MON810流散到環(huán)境中造成生態(tài)風險，因此能滿足于對抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810及其衍生品種生物安全監(jiān)管的需要。

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責任編輯：黃東杰