郭冬 李輝亮 楊子平 彭世清

摘 要 為研究橡膠樹中法尼基焦磷酸合酶基因（HbFPS）的表達調(diào)控機制，采用酵母單雜交技術(shù)篩選了膠乳中與HbFPS啟動子結(jié)合的蛋白因子。將HbFPS啟動子與報告質(zhì)粒pHIS2.1連接構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pHis-FPS，經(jīng)篩選確定抑制背景表達的3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）濃度為10 mmol/L。同時以橡膠樹膠乳mRNA為模板合成雙鏈cDNA，并將雙鏈cDNA、線性化的pGADT7Rec2載體和誘餌質(zhì)粒pHis-FPS共同轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，兩載體共轉(zhuǎn)化效率為1.7×106 cfu/μg。篩選共得到陽性克隆36個，獲得31條序列。對獲得的cDNA序列進行生物信息學分析，得到2個轉(zhuǎn)錄因子序列，分別為類乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子ERF003和HbLMYC2。結(jié)果為進一步研究HbFPS表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；法尼基焦磷酸合酶；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）是植物類異戊二烯合成途徑中的一個重要關(guān)鍵酶，催化2分子的異戊烯基焦磷酸和1分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4頭尾連續(xù)縮合反應，形成15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）[1]。FPP是植物體內(nèi)甾醇、三萜、長醇、泛醌、類胡蘿卜素、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體[2]。目前在植物中關(guān)于FPS的研究主要集中在基因克隆、表達特性分析和過量表達對次生代謝產(chǎn)物的影響[3-6]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)PS的過量表達會提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[7-8]，在青蒿（Artemisia annua）中過量表達AaFPS，轉(zhuǎn)基因植株中青篙素的含量比對照組高30%左右[9]；Chen等[10]將棉花的FPS在青篙中過量表達，轉(zhuǎn)基因發(fā)根系中青篙素含量約為對照組的3～4倍，轉(zhuǎn)基因植株中青篙素的含量比對照組高2～3倍；在積雪草（Centella asiatica）過量表達來自人參的FPS，轉(zhuǎn)基因植株中植物甾醇和三萜烯含量有明顯的提高[4]。而對FPS轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控因子的研究尚未見報道。

天然橡膠的生物合成是一種典型的植物類異戊二烯的次生代謝途徑。同位示蹤術(shù)和核磁共振成像技術(shù)的研究結(jié)果表明，F(xiàn)PP是橡膠生物合成的起始物[11]。橡膠生物合成的速率與細胞內(nèi)的FPP濃度呈正相關(guān)，F(xiàn)PP濃度越高，橡膠合成的速率越大[12]。由于HbFPS是天然橡膠生物合成途徑中的一個重要關(guān)鍵酶，因此，研究HbFPS的表達調(diào)控機制對促進天然橡膠生物合成有重要意義。尋找與HbFPS調(diào)控序列中順式作用元件特異結(jié)合蛋白，是進一步研究HbFPS表達調(diào)控機制的關(guān)鍵。酵母單雜交系統(tǒng)是目前廣泛應用于克隆和鑒定動植物轉(zhuǎn)錄因子的有效方法。本研究在分離HbFPS 5′調(diào)控序列的基礎(chǔ)上[13]，通過酵母單雜交技術(shù)篩選得到與其結(jié)合的蛋白，以期為獲得調(diào)控HbFPS表達的轉(zhuǎn)錄因子并研究其調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）7-33-97種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗農(nóng)場。采集幼葉進行橡膠樹基因組DNA提取。膠乳采樣按Tang等[14]的方法進行，再用液氮收集。

1.1.2 質(zhì)粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。mRNA 分離和純化試劑盒polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit、IPTG、X-gal和dNTPs購于promega公司。酵母單雜交系統(tǒng)MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit購自Clontech 公司。E.coli DH5α由本實驗室保存。DNA合成和測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HbFPS啟動子誘餌載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)pHIS2.1多克隆位點信息，對前期報道的HbFPS啟動子序列[13]進行酶切位點分析，設計一對特異上游和下游引物，并分別引入MluⅠ和SpeⅠ酶切位點，引物序列為pFPSF：5′-CCGACGCGTCTGCAT

TTTTATGATTAA-3′和pFPSR：5′-GCGACTAGTGG

ATTCAAACGGAGATTAG-3′。以橡膠樹基因組DNA為模板進行PCR反應。反應體系：在0.2 mL的離心管中加入1 μL DNA、10×PCR反應緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將純化的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19T simple Vector，轉(zhuǎn)至DH5α，抽提質(zhì)粒，測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD19-FPS。將pMD19-FPS用MluⅠ和SpeⅠ進行雙酶切并回收目標片段，連接到經(jīng)相同酶切的pHIS2.1載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，抽提質(zhì)粒用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定，獲得HbFPS啟動子誘餌載體pHis-FPS。

1.2.2 酵母單雜交誘餌載體背景表達抑制劑濃度的篩選 按照MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit的操作說明，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將誘餌載體pHis-FPS轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，將轉(zhuǎn)化液涂布于含不同濃度（0、5、10、20、30、40、60、80、100 mmol/L）3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）的酵母營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板上，30 ℃培養(yǎng)5～10 d后，觀察酵母生長情況。

1.2.3 膠乳總RNA的提取和雙鏈cDNA的合成

橡膠膠乳總RNA的提取參照Tang等[14]的提取方法進行。按照polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit的操作說明分離純化mRNA。應用MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit對所獲得mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到末端含SMARTTM Ⅲ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA。將獲得的雙鏈cDNA經(jīng)CHROMA SPINTM TE-400樹脂層析柱（Clontech公司）純化后備用。

1.2.4 cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞 按照MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit的操作要求，將5 μg誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS、20 μL雙鏈cDNA和3 μg經(jīng)SmaⅠ線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2，用LiAc/PEG法共轉(zhuǎn)化至酵母菌Y187感受態(tài)細胞中。將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞用6 mL 0.9% NaCl溶液重新懸浮，再按1/10、1/100和1/1000的比例分別稀釋，從稀釋液里各取100 μL分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp平板上培養(yǎng)，用于計算轉(zhuǎn)化效率。剩余酵母細胞懸浮液按100 μL每皿涂布在營養(yǎng)缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上篩選陽性克隆。平板放置30℃培養(yǎng)5～10 d后，觀察酵母生長情況。

1.2.5 酵母單雜交陽性克隆的篩選鑒定 根據(jù)pGADT7-Rec2載體中雙鏈cDNA插入?yún)^(qū)段兩側(cè)序列設計一對上下游引物S1：5′-TTCCACCCAAGCA

GTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′和S2：5′-GTATC

GATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′。選取營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)平板上生長直徑大于1 mm的酵母菌落進行菌落PCR篩選，PCR反應體系：在0.2 mL的離心管中加入少量酵母菌落、10×PCR反應緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，共30個循環(huán)。取7 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR鑒定的陽性克隆重新在營養(yǎng)缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上劃線培養(yǎng)，連續(xù)分離3代，通過酵母菌落PCR的方法選擇出同時具有文庫載體和誘餌載體的克隆。

1.2.6 陽性克隆序列分析 將鑒定為陽性克隆的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19T載體上，轉(zhuǎn)至DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證后測序。將測序結(jié)果進行blastx比對分析，確定目的基因所編碼的靶蛋白及其生物學功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbFPS啟動子誘餌載體的構(gòu)建

以橡膠樹基因組DNA為模板，PCR擴增獲得長約1.1 kb的HbFPS啟動子目標片段（圖1）。PCR產(chǎn)物連接到pMD19T 載體后用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切質(zhì)粒驗證，切下約1.1 kb片段，與目標帶型大小一致（圖2），陽性克隆測序結(jié)果與HbFPS啟動子序列完全相同，表明HbFPS啟動子誘餌載體構(gòu)建成功，命名為pHis-FPS。

2.2 誘餌載體pHis-FPS背景表達抑制劑濃度的篩選

將誘餌載體pHis-FPS轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，在含有不同濃度3-AT的SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板培養(yǎng)3～5 d后，觀察發(fā)現(xiàn)3-AT濃度達到20 mmol/L及以上時，幾乎沒有克隆長出，10 mmol/L時有少量克隆長出，5 mmol/L時長出克隆較多。又將SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板中分別加入4、6、8、10 mmol/L的3-AT再次篩選，結(jié)果顯示3-AT濃度為10 mmol/L時仍然只有少量克隆長出（圖3），因此將10 mmol/L的3-AT濃度作為酵母單雜交誘餌載體背景表達抑制劑濃度。

2.3 酵母單雜交雙鏈cDNA的合成

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的橡膠樹膠乳總RNA，結(jié)果顯示，總RNA有2條清晰的條帶（圖4），條帶均無拖尾現(xiàn)象，表明總RNA的提取未發(fā)生降解。紫外分光光度計測量樣品OD260/OD280=1.97，濃度為10.13 mg/mL，表明總RNA純度較高。將總RNA分離純化得到mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得末端含SMARTTMⅢ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA，并純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，純化后的雙鏈cDNA片段大小分布在300～2500 bp之間（圖5）。

2.4 酵母單雜交文庫的構(gòu)建和初步篩選

將純化后的雙鏈cDNA、誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS和線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2，共轉(zhuǎn)化至酵母菌Y187感受態(tài)細胞中，分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～10 d后發(fā)現(xiàn)，SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Trp/-Leu平板上均有較多克隆長出，表明誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS和線性化的融合表達載體pGADT7-Rec2同時轉(zhuǎn)入了酵母菌Y187細胞中。統(tǒng)計SD/-Trp/-Leu平板上共長出克隆284個，2種載體的共同轉(zhuǎn)化效率為1.7×106 cfu/μg。SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT平板共長出直徑大于1 mm的酵母菌落45個。

2.5 陽性克隆篩選和基因功能注釋

使用載體特異引物S1和S2對45個直徑大于1 mm的酵母菌落進行菌落PCR篩選，共36個克隆擴增出清晰條帶，均大于350 bp（空載體引物約300 bp）。其中擴增條帶大于1 kb的克隆有12個，大于750 bp的克隆14個，大于350 bp的克隆10個。圖6為部分酵母菌落PCR檢測結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物連接到T載體pMD19T上，篩選陽性克隆進行測序。共測序36條，除去因特殊結(jié)構(gòu)未測出序列，共獲得31條可讀序列。

將獲得序列去除載體后，使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastx工具進行同源比對分析。去除匹配重復的蛋白序列后，篩選到的蛋白多為功能未知蛋白。經(jīng)過多次篩選，得到2個轉(zhuǎn)錄因子序列可能與HbFPS啟動子序列結(jié)合：一個序列編號FPSYOH12，共分離cDNA序列623 bp，推導最大編碼171個氨基酸，其中2～40 aa預測為AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，blastx比對結(jié)果顯示，該序列與葡萄中乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子ERF003（登錄號：XP002285373）同源性為76%（圖7-a）；另一個序列編號FPSYOH26，共分離cDNA序列624 bp，推導最大編碼180個氨基酸，其中9～59 aa預測為bHLH類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，blastx比對結(jié)果顯示，該序列與橡膠樹HbLMYC2 cDNA序列（登錄號：HM061097）同源性高達為97%（圖7-b）[15]。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子作為一種DNA結(jié)合蛋白，通過與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，調(diào)節(jié)基因表達的強度或控制靶基因的時空特異性表達，應答激素刺激和外界環(huán)境的脅迫，在植物生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用。酵母單雜交技術(shù)根據(jù)體內(nèi)DNA結(jié)合蛋白與順式作用元件結(jié)合調(diào)控報告基因表達的原理，已成為分離轉(zhuǎn)錄因子的有效手段。本研究將HbFPS的啟動子區(qū)段構(gòu)建到酵母單雜交誘餌載體pHIS2.1上，以期獲得能夠調(diào)控HbFPS基因的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示，筆者初步篩選得到乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子ERF003和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子HbLMYC2與HbFPS啟動子區(qū)段結(jié)合。ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子超級家族中的一個亞家族，ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因受多種植物激素誘導，如乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等，干旱、鹽堿、低溫、病害、機械損傷等生物與非生物脅迫也會誘導其表達。ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與植物體內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導途徑，在植物體的抗逆性調(diào)控中發(fā)揮著不可替代的作用，同時在調(diào)控植物的生長發(fā)育中也發(fā)揮著作用[16]。MYC轉(zhuǎn)錄因子家族是bHLH超家族的一種，是植物激素（如茉莉酸、乙烯、脫落酸等）響應途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，具有多種調(diào)節(jié)功能，并廣泛存在與動植物中[17]。MYC2是已發(fā)現(xiàn)植物MYC類轉(zhuǎn)錄因子中研究最為深入的一個，擬南芥MYC2轉(zhuǎn)錄因子通過形成COI1/JAZ/MYC2復合體發(fā)揮調(diào)控作用，參與茉莉酸、脫落酸等植物激素信號轉(zhuǎn)導過程[18]。最近研究結(jié)果表明，MYC2轉(zhuǎn)錄因子受赤霉素和茉莉酸信號的協(xié)同調(diào)控，直接激活擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11來調(diào)控倍半萜的合成和釋放，促進擬南芥花中倍半萜的合成[19]。通過對HbFPS啟動子序列的順式作用元件分析，該區(qū)段含有響應乙烯的順式作用元件ERELEE4（AWTTCAAA，-1027）和MYC的順式作用元件（CANNTG，-936）[20-21]，筆者推測所獲得轉(zhuǎn)錄因子與這些元件結(jié)合，從而響應上游轉(zhuǎn)導信號對HbFPS表達調(diào)控，但具體的結(jié)合元件和調(diào)控機理還有待進一步驗證和研究。

參考文獻

[1] Closa M， Vranova E， Bortolotti C， et al. The Arabidopsis thaliana FPP synthase isozymes have overlapping and specific functions in isoprenoid biosynthesis， and complete loss of FPP synthase activity causes early developmental arrest[J]. Plant J， 2010， 63：512-525.

[2] Szkopińska A， Plochocka D. Farnesyl diphosphate synthase： regulation of product specificity[J]. Acta Biochim Pol， 2005， 52：45-55.

[3] Kim O T， Bang K H， Jung S J， et al. Molecular characterization of ginseng farnesyl diphosphate synthase gene and its up-regulation by methyl jasmonate[J]. Biol Plant， 2010， 54： 47-53.

[4] Kim O T， Kim S H， Ohyama K， et al. Upregulation of phytosterol and triterpene biosynthesis in Centella asiatica hairy roots overexpressed ginseng farnesyl diphosphate synthase[J]. Plant Cell Rep， 2010， 29： 403-411.

[5] Kenmotsu Y， Ogita S， Katoh Y， et al. Methyl jasmonate-induced enhancement of expression activity of Am-FaPS-1， a putative farnesyl diphosphate synthase gene from Aquilaria microcarpa[J]. J Nat Med， 2011， 65： 194-197.

[6] Cao X， Yin T， Miao Q， et al. Molecular characterization and expression analysis of a gene encoding for farnesyl diphosphate synthase from Euphorbia pekinensis Rupr[J]. Mol Biol Rep， 2012， 39： 1 487-1 492.

[7] Wu S， Schalk M， Clark A. Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants[J]. Nat Biotechnol， 2006， 24： 1 441-1 447.

[8] van Herpen T W， Cankar K， Nogueira M. Nicotiana benthamiana as a production platform for artemisinin precursors[J]. PLoS One， 2010， 5： e14222.

[9] Han J L， Liu B Y， Ye H C， et al. Effects of Overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Artemisia annua L[J]. J Integr Plant Biol， 2006， 48：482-487.

[10] Chen D H， Ye H C， Li G F. Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L. transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[J]. Plant Sci， 2000， 155： 179-185.

[11] Tangpakdee T， Tanaka Y. Long-chain polyprenols and rubber in young leaves of Hevea brasiliensis[J]. Phytochem， 1998， 48：447-450.

[12] Lange B M， Rujan T， Martin W， et al. Isoprenoid biosynthesis： the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97： 13 172-13 177.

[13] 郭 冬， 李輝亮， 彭世清. 巴西橡膠樹法尼基焦磷酸合酶基因5'調(diào)控序列的克隆及功能初步鑒定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程， 2010， 34： 31-36.

[14] Tang C， Qi J， Li H， et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. J Biochem Biophys Methods， 2007， 70：749-754.

[15] Zhao Y， Zhou L M， Chen Y Y， et al. MYC genes with differential responses to tapping， mechanical wounding， ethrel and methyl jasmonate in laticifers of rubber tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. J Plant Physiol， 2011， 168： 1 649-1 658.

[16] Sharma M K， Kumar R， Solanke A U， et al. Identification， phylogeny， and transcript profiling of ERF family genes during development and abiotic stress treatments in tomato[J]. Mol Genet Genomics， 2010， 284： 455-475.

[17] Pires N， Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants[J]. Mol Biol Evol， 2010， 27： 862-874.

[18] Chini A， Boter M， Solano R. Plant oxylipins： COI1/JAZs/MYC2 as the core jasmonic acid-signalling module[J]. FEBS J， 2009， 276： 4682-4692.

[19] Hong G J， Xue X Y， Mao Y B， et al. Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthase gene expression[J]. Plant Cell， 2012， 24： 2 635-2 648.

[20] Rawat R， Xu Z F， Yao K M， et al. Identification of cis-elements for ethylene and circadian regulation of the Solanum melongena gene encoding cysteine proteinase[J]. Plant Mol Biol， 2005， 57： 629-643.

[21] Abe H， Urao T， Ito T， et al. Arabidopsis AtMYC2（bHLH）and AtMYB2（MYB）function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. Plant Cell， 2003， 15： 63-78.

責任編輯：趙軍明