γ—氨基丁酸對香蕉果實采后成熟的調(diào)控作用及其生理機(jī)制

胡偉 顏彥 徐碧玉 金志強(qiáng)

摘 要 香蕉是世界上最重要的水果之一，研究香蕉采后成熟與調(diào)控對香蕉品質(zhì)形成及創(chuàng)新采后催熟技術(shù)具有重要意義。本實驗室前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實成熟密切相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上，根據(jù)香蕉果實達(dá)到全黃并有黑色斑點期（YB）成熟度的天數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出MaGAD1基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑γ-氨基丁酸（GABA）能夠促進(jìn)香蕉果實采后成熟。生理學(xué)分析結(jié)果表明，外源GABA能夠促使香蕉果實提前發(fā)生生理躍變。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，外源GABA能夠誘導(dǎo)MaGAD1和MaACS1上調(diào)表達(dá)。因此，GABA通過誘導(dǎo)MaGAD1和MaACS1上調(diào)表達(dá)及促進(jìn)香蕉果實生理躍變，從而促進(jìn)香蕉果實采后成熟。本研究不僅從理論上證明了GABA能夠促進(jìn)果實成熟，揭示了GABA促進(jìn)果實成熟生理機(jī)制，并且從實際生產(chǎn)上為蕉催熟的應(yīng)用提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞 香蕉；采后成熟；乙烯生物合成；MaGAD1；γ-氨基丁酸

中圖分類號 Q344 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

香蕉是世界上最重要的水果之一，也是世界第4大糧食作物。香蕉是典型的呼吸躍變型果實，其采后成熟過程中有大量的乙烯產(chǎn)生，并出現(xiàn)呼吸躍變峰，同時引起生理生化變化，如淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)樘?、多酚的降解、結(jié)構(gòu)碳水化合物的酶解。這些生理變化的發(fā)生最終會影響果實的硬度、澀味、香味、顏色及貨架期，進(jìn)而影響到香蕉的商品價值[1]。因此，香蕉采后成熟的研究是香蕉果實生長發(fā)育研究的核心內(nèi)容。研究香蕉采后成熟及調(diào)控機(jī)理、創(chuàng)新采后催熟技術(shù)具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。

乙烯是香蕉采后成熟的重要調(diào)控因子，它能夠誘導(dǎo)香蕉果實發(fā)生呼吸躍變，從而導(dǎo)致生理變化和品質(zhì)形成。ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途徑中的2個關(guān)鍵酶[2]。1999年，Liu等[3]系統(tǒng)研究了乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因與香蕉果實采后成熟的關(guān)系，實驗結(jié)果表明，MaACS1和MaACO1與香蕉采后成熟過程密切相關(guān)，并且能被外源乙烯誘導(dǎo)；香蕉采后成熟的躍變期乙烯生物合成主要受MaACS1調(diào)控，而在躍變后主要受MaACO1調(diào)控。2006年，Huang等[4]進(jìn)一步提出MaACS1是香蕉果實成熟過程中起主要作用的基因。

谷氨酸脫羧酶（GAD）能夠與磷酸吡哆醛輔因子結(jié)合催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。植物在應(yīng)對外界刺激時，GAD被細(xì)胞內(nèi)的H+或Ca2+水平的增加而激活，從而導(dǎo)致GABA大量積累。細(xì)胞內(nèi)GABA積累與植物pH調(diào)控、N儲存、植物發(fā)育、果實成熟等生理過程密切相關(guān)[5-6]。但GAD及其產(chǎn)物GABA在乙烯生物合成及果實成熟中的作用較少地被研究。Kathiresan等[7]研究發(fā)現(xiàn)外源GABA能夠通過誘導(dǎo)GAD活力和ACS基因表達(dá)，從而促進(jìn)向日葵內(nèi)源乙烯的生物合成。另外，先前的研究從番茄、柑橘等果樹中分離出1個GAD基因，表達(dá)分析結(jié)果表明，GAD基因在果實成熟不同階段具有差異表達(dá)的特征[6，8-9]。最近，Liu等[10]從柑橘中分離出2個GAD基因（CsGAD1、CsGAD2），表達(dá)分析生理學(xué)分析結(jié)果表明，隨著柑橘果實中可滴定酸含量的降低，CsGAD1基因的表達(dá)及GAD活力顯著增加。然而，值得注意的是，外施GABA是否能夠影響果實成熟尚不明確，外源GABA影響果實成熟的生理機(jī)制尚不清楚。

筆者前期的研究利用抑制差減雜交及cDNA微陣列，篩選正常成熟條件下香蕉果實采后乙烯躍變啟始時差異表達(dá)的基因。結(jié)果表明，與采后0 d相比較，GAD基因的cDNA片段的表達(dá)量顯著上調(diào)，并且是所獲得的289個cDNA片段中表達(dá)量最高的[11-12]。隨后，筆者克隆了該基因（MaGAD1），并對其在香蕉采后不同成熟階段的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實成熟密切相關(guān)[13]。本研究以MaGAD1為靶基因，篩選MaGAD1表達(dá)的誘導(dǎo)劑，探索MaGAD1表達(dá)的誘導(dǎo)劑對香蕉采后成熟的調(diào)控作用，揭示其作用的生理機(jī)制。這些研究結(jié)果不僅從理論上證明GABA能夠促進(jìn)果實成熟及相關(guān)生理機(jī)制，并且從實際生產(chǎn)上提供一種能夠應(yīng)用于香蕉催熟的新方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）果實采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香蕉研究所澄邁香蕉種植基地。香蕉斷蕾110 d后，采收香蕉果實（成熟度為全綠期），切割成單個果指，用0.1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒10 min，并用無菌水清洗3次。將香蕉采后成熟過程劃分為7個階段：全綠期（FG）、黃色出現(xiàn)期（TY）、綠多于黃色期（MG）、黃多于綠色期（MY）、綠色輕微存在期（GT）、全黃期（FY）、全黃并有黑色斑點期（YB）[14]。

香蕉果實催熟劑篩選實驗將香蕉果實分成3組（每組36個果指）：正常成熟、GABA處理以及幾丁聚糖與谷氨酸混合物處理。正常成熟：將香蕉果實放于25 ℃培養(yǎng)室，待其自然成熟，并觀察達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間。GABA處理：將GABA配成200、20、2 mmol/L共3個濃度梯度（每個濃度處理12個果指），每個濃度下再浸泡香蕉果實5、30、120、240 min等4個時間，然后將其放于25 ℃培養(yǎng)室，觀察記錄每小組香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間（每個處理時間處理3個果指）。幾丁聚糖與谷氨酸混合物處理：將幾丁聚糖與谷氨酸混合物配成5 000 mg/L+500 mmol/L、500 mg/L+50 mmol/L、50 mg/L+5 mmol/L共3個濃度梯度（每個濃度處理12個果指），每個濃度下再浸泡香蕉果實5、30、120、240 min等4個時間（每個處理時間處理3個果指），然后將其放于25 ℃培養(yǎng)室，觀察記錄每小組香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間。每個樣品做3次生物學(xué)重復(fù)。

GABA處理實驗將香蕉果實分成2組（每組21個果指）：正常成熟和GABA處理。正常成熟：將香蕉果實放于25 ℃培養(yǎng)室，待其自然成熟，并觀察記錄香蕉果實達(dá)到每一個成熟度的時間。GABA處理：用2 mmol/L GABA處理香蕉果實240 min，將其放于25 ℃培養(yǎng)室，觀察記錄香蕉果實達(dá)到每一個成熟度的時間。在正常成熟及GABA處理下，香蕉果實達(dá)到每一個成熟度時取樣測定相關(guān)生理指標(biāo)（每個樣品測定3個果指）。另外，以GABA處理香蕉果實達(dá)到7個成熟度的時間為標(biāo)準(zhǔn)，對2種處理取樣。取樣后將果實切成小塊立即置于液氮中，保存于-70 ℃冰箱中用以香蕉果實RNA的提取。每個樣品做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果實生理指標(biāo)的測定 香蕉果實硬度的測定：根據(jù)杭州托普儀器有限公司硬度測定儀說明書測定香蕉果實硬度。每個果指測定3次，每個樣品測3個果指。

香蕉果實可溶性糖含量的測定：取3個香蕉果指，去除果皮，將果肉切成小塊，用液氮冷凍后壓碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用8 mL蒸餾水研磨，轉(zhuǎn)入離心管中，用塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，連續(xù)提取2次，提取液過濾入25 mL容量瓶中，定容至刻度。取30 μL樣品液加入0.47 mL蒸餾水，再加入9% 0.25 mL苯酚溶液，搖勻，再從管液正面迅速加入 1.25 mL濃硫酸，搖勻。室溫下放置30 min，在485 nm波長下測定吸光度[15]。每個樣品測定3次。

香蕉果實淀粉含量的測定：取3個香蕉果指，去除果皮，將果肉切成小塊，用液氮冷凍后壓碎混合。參照徐昌杰等[16]的方法，取0.5 g香蕉果肉，用5 mL 80%乙醇研磨，轉(zhuǎn)入離心管離心，殘渣8 mL用80% Ca（NO3）2溶液懸浮后在沸水中溫浴10 min，離心后將上清轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，殘渣用80% Ca（NO3）2溶液重復(fù)提取2次，合并提取液，定容至25 mL。取淀粉樣品1.8 mL，加入0.2 mL 0.01N I2-KI，搖勻，于620 nm下測定光吸收值。每個樣品測定3次。

1.2.2 香蕉果實乙烯生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析 首先用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析軟件分析MaACO1、MaACS1、MaGAD1、MaActin1 4個基因的保守區(qū)域，確保所設(shè)計引物的擴(kuò)增片段位于非保守區(qū)；然后根據(jù)熒光定量PCR的引物設(shè)計原則，用primer premier 5設(shè)計引物，并通過測序分析確定引物的準(zhǔn)確性。引物序列見表1。在Stratagene的Mx3000P儀器上進(jìn)行熒光定量PCR。在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA）0.5 μL、5 μmol/L的1對引物各0.75 μL，cDNA樣品1 μL，然后用水補(bǔ)足至25 μL。每個樣品既要用于擴(kuò)增目的基因又要擴(kuò)增內(nèi)參基因MaActin1，各個基因的擴(kuò)增都做3個重復(fù)。按照94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增（4個基因的反應(yīng)程序是一致的），并于每個循環(huán)的延伸階段采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后做94～55 ℃的融解曲線分析。采用2-△△CT相對定量方法[17]研究基因表達(dá)量的差異，該方法無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將0 d的cDNA模板視為對照樣品，其它天數(shù)的視為不同處理的樣品，以看家基因MaActin1為內(nèi)參基因，儀器自帶的分析軟件即可自動生成表達(dá)變化的曲線。每個樣品做3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAD基因誘導(dǎo)劑對香蕉采后成熟的影響

在正常成熟條件下，香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間為8 d。在200 mmol/L GABA處理條件下，與正常成熟相比，處理0～30 min對香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間沒有變化；處理120 min或240 min，香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間為9 d（比正常成熟推遲1 d）。在20 mmol/L GABA處理條件下，與正常成熟相比，處理0～120 min對香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間沒有變化；處理240 min，香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間為7 d（比正常成熟提前1 d）。在2 mmol/L GABA處理條件下，與正常成熟相比，處理0～5 min對香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間沒有變化；處理30～240 min都能促進(jìn)香蕉果實成熟（30或120 min比正常成熟提前1 d；240 min比正常成熟提前2 d）。上述結(jié)果表明，外施GABA能夠促進(jìn)香蕉果實成熟，最適的處理濃度為2 mmol/L，最適的處理時間為240 min（圖1-A）。而且，從圖1-C中可以發(fā)現(xiàn)，在2 mmol/L GABA處理香蕉果實240 min后，8 d香蕉果實的黑色斑點比正常對照多。所以，GABA對香蕉果實具有顯著的催熟效果。

另外，5 000 mg/L幾丁聚糖與500 mmol/L 谷氨酸的混合物及500 mg/L幾丁聚糖與50 mmol/L 谷氨酸的混合物對香蕉果實成熟沒有催熟效果，反而有一定的抑制效果；50 mg/L幾丁聚糖與5 mmol/L 谷氨酸的混合物處理30～240 min能夠輕微促進(jìn)香蕉果實成熟。上述結(jié)果表明，幾丁聚糖與谷氨酸的混合物對香蕉果實的催熟效果不明顯（圖1-B）。

2.2 GABA對香蕉采后成熟過程的影響

為了進(jìn)一步確證GABA對香蕉采后果實的催熟作用，用2 mmol/L GABA處理香蕉果實240 min，觀察處理后的香蕉果實達(dá)到各個成熟度的時間。由表2可知，除了在FG成熟度（采后0 d），GABA處理后香蕉果實達(dá)到其它每一個成熟度的時間都比正常對照提前，達(dá)TY成熟度時提前1 d，達(dá)MG-YB成熟度時提前3 d。上述結(jié)果表明，GABA處理能夠顯著提前香蕉果實達(dá)到TY-YB成熟度的時間。

2.3 GABA對香蕉采后生理的影響

在正常成熟條件下，采后香蕉果實的硬度和淀粉含量在0～7 d內(nèi)緩慢下降，在8～9 d內(nèi)急劇下降，在9～11 d內(nèi)緩慢下降（圖2-A、B）；可溶性糖含量在0～7 d內(nèi)緩慢上升，在8～9 d內(nèi)急劇上升，在9～11 d內(nèi)緩慢上升（圖2-C）。上述結(jié)果表明，在正常成熟條件下，香蕉果實在8-9 d出現(xiàn)生理上的顯著變化。

在GABA處理條件下，采后香蕉果實的硬度和淀粉在處理后的0～3 d內(nèi)緩慢下降，在4～5 d內(nèi)急劇下降，在6～8 d內(nèi)緩慢下降（圖2-D、E）；而可溶性糖含量在0～3 d內(nèi)緩慢上升，在4～5 d內(nèi)急劇上升，在6～8 d內(nèi)緩慢上升（圖2-F）。上述結(jié)果表明，在GABA處理條件下，香蕉果實在4～5 d出現(xiàn)生理上的顯著變化。

2.4 GABA對香蕉采后乙烯生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

在正常成熟條件下，MaACO1的表達(dá)沒有明顯的規(guī)律（圖3-B）；但是，MaGAD1和MaACS1的表達(dá)在香蕉采后0～7 d內(nèi)都維持在較低的水平，在采后第8天顯著提高（圖3-A、C）。與采后第7天相比較（1.020），MaGAD1表達(dá)在采后第8天（5.559）提高了5倍（圖3-A）。與采后第7天相比較（1.713），MaACS1表達(dá)在采后第8天（3.891）提高了2倍（圖3-C）。上述結(jié)果表明，MaGAD1和MaACS1的表達(dá)在香蕉采后成熟過程中具有一致的趨勢，并且在采后第8天顯著提高。

在GABA處理條件下，MaGAD1表達(dá)量在0～3 d較低1.000～0.241，在第4天達(dá)到2.249，在第5天達(dá)出現(xiàn)第一次峰值11.270（圖3-D）。MaACO1表達(dá)量在0～4 d較低1.000～0.496，在第5天達(dá)出現(xiàn)第一次峰值3.146（圖3-E）。MaACS1表達(dá)量在0～3 d較低1.000～0.117，在第4天達(dá)到8.269，在第5天出現(xiàn)第一次峰值25.473（圖3-F）。上述結(jié)果表明，在GABA處理下，MaGAD1表達(dá)趨勢與MaACS1和MaACO1一致，都在采后第5天出現(xiàn)第一次峰值，比正常成熟達(dá)到最大值提前3 d；同時，與正常成熟相比，這3個基因的表達(dá)水平都被顯著誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)香蕉采后成熟的劃分標(biāo)準(zhǔn)，YB期是香蕉采后成熟的完成期，并且是香蕉采后品質(zhì)形成的重要階段[15]。所以，本研究以香蕉果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的天數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選對采后香蕉果實具有催熟作用的試劑，并確定其最適的處理時間和處理濃度。筆者前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實成熟密切相關(guān)[14]。因此可以推測，體外誘導(dǎo)MaGAD1基因上調(diào)表達(dá)可能會促進(jìn)香蕉采后成熟。根據(jù)這一思路，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，GABA及谷氨酸、幾丁聚糖的混合物能夠顯著誘導(dǎo)GAD基因上調(diào)表達(dá)[18-19]。所以，分別用GABA及谷氨酸、幾丁聚糖的混合物處理香蕉果實，測定處理后的果實達(dá)到Y(jié)B成熟度的時間，從而確定GABA以及谷氨酸和幾丁聚糖的混合物對香蕉采后的催熟效果。結(jié)果表明，低濃度GABA能夠促進(jìn)香蕉果實成熟，而高濃度GABA輕微推遲了香蕉果實成熟。這一研究結(jié)果證實了低濃度GABA能夠促進(jìn)香蕉果實采后成熟。

香蕉是典型的躍變型果實，其采后成熟經(jīng)歷了一系列的呼吸躍變過程。隨著呼吸躍變的發(fā)生，香蕉果實也產(chǎn)生了相關(guān)的生理變化，如果實軟化[20]、淀粉降解和可溶性糖含量增加[21-22]。這些生理變化的發(fā)生會影響香蕉果實的硬度、芳香物質(zhì)、顏色和貨架期，最終決定了香蕉果實的品質(zhì)。既然GABA能夠顯著促進(jìn)香蕉果實采后成熟，那么是否外施GABA能夠影響香蕉果實的生理變化是一個值得探索的問題。所以，筆者測定了正常成熟及GABA處理條件的香蕉果實的硬度、淀粉含量和可溶性糖含量。結(jié)果表明，GABA處理導(dǎo)致香蕉果實生理躍變提前4～5 d。這一研究結(jié)果從生理學(xué)的角度支持了GABA通過影響香蕉采后生理變化促進(jìn)香蕉果實成熟。

乙烯是香蕉采后成熟的重要調(diào)控因子。Liu等[3]報道乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因MaACO1和MaACS1在香蕉采后成熟過程中起著重要作用。在香蕉采后成熟過程中，乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)促進(jìn)了乙烯的生物合成、果實的生理變化及品質(zhì)的形成。所以，筆者推測GABA促進(jìn)香蕉采后成熟及相關(guān)生理躍變可能與乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)密切相關(guān)。為了確證這一科學(xué)問題，筆者測定了在正常成熟及GABA處理條件下香蕉果實MaACO1和MaACS1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，GABA處理導(dǎo)致香蕉乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因MaACO1和MaACS1的表達(dá)出現(xiàn)峰值的時間提前3 d。這一研究結(jié)果從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步支持了GABA通過影響MaACO1和MaACS1的表達(dá)促進(jìn)香蕉果實采后成熟。

本研究是根據(jù)文獻(xiàn)報道GABA能夠顯著誘導(dǎo)GAD基因上調(diào)表達(dá)[18]，深入研究GABA對香蕉采后成熟的影響及相關(guān)生理機(jī)制，那么GABA是否能夠誘導(dǎo)MaGAD1上調(diào)表達(dá)必需得到證實。所以，筆者測定了在正常成熟及GABA處理條件下香蕉果實MaGAD1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，GABA能夠顯著誘導(dǎo)MaGAD1上調(diào)表達(dá)。而且，在GABA處理條件下，MaGAD1表達(dá)峰值出現(xiàn)的時間與MaACS1和MaACO1表達(dá)峰值出現(xiàn)的時間一致，并且與香蕉果實生理躍變發(fā)生的時間一致。綜上所述，GABA通過誘導(dǎo)MaGAD1、MaACS1、MaACO1上調(diào)表達(dá)和加快香蕉果實生理躍變，來促進(jìn)香蕉果實的采后成熟。

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責(zé)任編輯：黃東杰