芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定

蒲金基 張賀 楊石有 楊慧杰 劉曉妹

摘 要 采用生長速率法測(cè)定了采自中國芒果主產(chǎn)區(qū)、泰國、夏威夷等地的127個(gè)芒果炭疽菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果表明，芒果炭疽菌株對(duì)甲基硫菌靈的EC50值范圍為0.005 7～7.850 5 μg/mL，最大EC50值是最小EC50值的1 377倍。不同地區(qū)、不同染病部位、不同年份的芒果炭疽菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性不同，采自四川菌株敏感性最低，采自夏威夷菌株敏感性最高；不同分離部位敏感性程度依次為枝、果、葉；2011～2013年，菌株敏感性逐年降低，存在很大的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞 芒果；炭疽病菌；甲基硫菌靈；敏感性

中圖分類號(hào) S481 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

芒果炭疽病是芒果生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的一種病害，在世界芒果種植區(qū)內(nèi)均有發(fā)生[1]，也是貯藏期最主要病害之一，已成為芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的限制性因素之一[2]，其病原菌主要以膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.& Sacc.]為主。該病主要為害芒果葉片、嫩梢、花序和果實(shí)，可造成植株葉枯、梢枯、落花落果和采后果實(shí)大量腐爛[3]。病原菌寄主范圍極為廣泛，除為害芒果外，絕大多數(shù)熱帶亞熱帶果樹均是其重要寄主[4]。

甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）又名甲基托布津，由日本曹達(dá)株式會(huì)社研制開發(fā)的一種廣譜內(nèi)吸性低毒殺菌劑，能防治多種真菌病害，具有內(nèi)吸、預(yù)防和治療作用。甲基硫菌靈與苯菌靈、噻菌靈等苯并咪唑類殺菌劑，是目前生產(chǎn)上防治芒果炭疽病采用的主要?dú)⒕鷦5]。甲基硫菌靈被植物吸收后即轉(zhuǎn)化為多菌靈，主要干擾病原菌菌絲的形成，影響病原菌細(xì)胞分裂，孢子萌發(fā)長出畸形芽管，從而抑制或殺死病原菌[6]。由于該類藥劑作用靶標(biāo)專一，長期單一使用很容易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致防效下降或喪失，殺菌劑抗藥性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）將其歸為高風(fēng)險(xiǎn)類[7]。葉佳等[8]對(duì)浙江省杭州、嵊州和嘉興3地78個(gè)葡萄炭疽菌（C. gloeosporioides）抗藥性研究發(fā)現(xiàn)，其抗性頻率為51.3%；陳聃等[9]通過對(duì)浙江省108株葡萄炭疽菌對(duì)甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性研究發(fā)現(xiàn)已有37.04%的菌株對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗藥性；陳新建等[10]研究發(fā)現(xiàn)蘆筍莖枯病菌（Phompsis asparagi）已經(jīng)對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性；楊煒華等[11]研究發(fā)現(xiàn)蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp. piricola）對(duì)甲基硫菌靈已經(jīng)產(chǎn)生了中度的抗藥性。Spalding[12]報(bào)道了C. gloeosporioides對(duì)苯菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈存在正交互抗性；此外，在南非、印度等國報(bào)道了芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[13-15]。

近年來的田間觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈在芒果園內(nèi)的防治效果有所降低，這可能是敏感性降低或抗藥性的緣故，但尚缺乏大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)。為全面探討芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性問題，本研究從中國芒果主產(chǎn)區(qū)、美國夏威夷州和泰國等地采集、鑒定127個(gè)菌株，開展其對(duì)甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定，繪制敏感性頻率分布圖，為病害的科學(xué)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2005年～2013年從海南、廣東、廣西、云南、四川以及泰國和美國夏威夷州等芒果產(chǎn)區(qū)采集感病的葉、莖和果等樣品，包括貴妃芒、青黃芒、金煌芒、象牙芒、臺(tái)農(nóng)1號(hào)芒、紅芒、紫花芒、凱特芒、呂宋芒、粵西2號(hào)、澳芒R2E2、玉文芒、蛋芒和三年芒等14個(gè)品種。所有樣品經(jīng)組織分離、單孢純化、鑒定后接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，低溫保存?zhèn)溆?。累?jì)獲得單孢菌株127株，其中海南60株，廣東12株，廣西16株，四川9株，云南16株，泰國9株，美國夏威夷州5株。

1.1.2 供試藥劑 96%甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）原藥（江蘇龍燈化學(xué)有限公司），丙酮（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基制備 準(zhǔn)確稱取0.052 1 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%甲基硫菌靈原藥，加入250 mL容量瓶中，用丙酮溶解配成有效成分的質(zhì)量濃度為200 μg/mL的甲基硫菌靈母液。采用系列濃度稀釋法配成不同質(zhì)量濃度的藥劑，用移液槍分別移取不同系列濃度的藥劑5 mL加入到冷卻至50 ℃左右195 mL的PDA培養(yǎng)基中，充分混合均勻，制成實(shí)驗(yàn)所需的含藥培養(yǎng)基平板。每處理濃度重復(fù)3次，以不加藥劑而含等量丙酮的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.2 芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈敏感性測(cè)定

采用菌絲生長速率法[16]。各實(shí)驗(yàn)菌株在PDA平板培養(yǎng)好后，用無菌打孔器取d=5 mm的菌餅，移至含不同甲基硫菌靈質(zhì)量濃度的平板上，每濃度重復(fù)3次，28 ℃下黑暗培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，以濃度對(duì)數(shù)（x）為橫軸與抑制菌落生長百分率的機(jī)率值（y）為縱軸求甲基硫菌靈對(duì)病原菌的毒力回歸方程y=ax+b，并計(jì)算抑制菌體生長的有效中濃度EC50值及R2。抑制率公式如下[17-18]。

抑制率=×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果炭疽病菌菌株對(duì)甲基硫菌靈敏感性測(cè)定結(jié)果

127株供試菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定結(jié)果表明：芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性存在明顯的差異；EC50值介于0.005 7～7.850 5 μg/mL之間，平均值為0.878 9 μg/mL，EC50值高于平均值的菌株有33個(gè)，占總數(shù)的25.98%。菌株Mcg-265（四川省攀枝花市）的EC50 值最大（7.850 5 μg/mL），菌株Mcg-265（海南省樂東縣）的EC50 值次之（7.666 6 μg/mL），2者均>7.0 μg/mL；菌株Mcg-112（海南省三亞市）的EC50值最?。?.005 7 μg/mL），最大EC50值是最小值的1 377倍、平均值的9.3倍。供試菌株中已有部分菌株敏感性開始降低，尚未上升為優(yōu)勢(shì)群體（圖1）。本研究結(jié)果所測(cè)定得到的平均值可作為芒果炭疽菌的敏感性基線，為后續(xù)的抗藥性監(jiān)測(cè)與治理提供參考。

2.2 不同地區(qū)芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性水平

不同地區(qū)的127個(gè)菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定結(jié)果表明：不同地區(qū)的芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性存在明顯差異；海南菌株EC50值為0.005 7～7.666 6 μg/mL、均值為0.920 2 μg/mL，菌株之間差異最大；四川菌株EC50值為0.341 8～7.850 5 μg/mL、均值最大，菌株之間的差異相對(duì)略??；廣西菌株EC50值為0.010 9～0.902 2 μg/mL、均值較小，菌株之間的差異中等；不同地區(qū)菌株的EC50最大值和最小值同樣存在較大差異，海南省的菌株EC50最大值是最小值的1 345倍，泰國的菌株為391倍，而其他地區(qū)的差異則在23～84倍（表1）。

2.3 不同染病部位菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性比較

通過對(duì)比3個(gè)不同分離部位的芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性結(jié)果表明：不同分離部位的菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性也存在差異，其中從葉片上分離的菌株對(duì)甲基硫菌靈的EC50值為0.005 7～7.850 5 μg/mL、 均值最大（0.914 7 μg/mL），表明分離自葉片的分布范圍最廣，菌株之間的差異最大；從枝條上分離的菌株對(duì)甲基硫菌靈的EC50值為0.013 6～1.285 9 μg/mL、均值最?。?.595 3 μg/mL），表明分離自枝條的EC50值范圍與差異程度均低于葉片；不同分離部位的敏感性程度由高到低依次為枝、果、葉（表2）。

2.4 連續(xù)3年菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性比較

對(duì)比2011～2013年連續(xù)3年在國內(nèi)芒果主產(chǎn)區(qū)所采集的菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性發(fā)現(xiàn)，供試菌株不同年份的敏感性有所不同，呈下降趨勢(shì)；EC50均值逐年增高，2012年和2013年分別增加12.37%、25.11%（表3）。表明芒果炭疽病菌的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)在逐年增加。

3 討論與結(jié)論

利用化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害是植物病害綜合防治措施之一，具有見效快、防病效果好等優(yōu)點(diǎn)，但如果長期施用單一殺菌劑，則易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[19]。生產(chǎn)上常用苯菌靈、多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑來防治芒果炭疽病，隨著使用年限和用量的增加，芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）逐漸對(duì)該類藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。

本研究通過127株芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，病原菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性存在明顯差異，不同采集地區(qū)、分離部位和菌株收集年份的敏感性差異明顯。不同地區(qū)菌株之間的差異以海南最大，泰國其次，但均高于美國夏威夷州的菌株。泰國是芒果的重要發(fā)源地之一，具有悠久的種植歷史，其田間芒果炭疽病防治主要依靠化學(xué)藥劑，從而導(dǎo)致其病原菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性差異較大，EC50均值較高，與中國芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性情況較為類似。而美國夏威夷州由太平洋中的夏威夷群島組成，離芒果主栽區(qū)的距離較遠(yuǎn)，使用殺菌劑的頻次較低，甚至不使用殺菌劑，這與該地菌株的敏感性較高有一定的相關(guān)性。從而說明菌株對(duì)藥劑的敏感性與不同地區(qū)的用藥水平和施藥次數(shù)有關(guān)，也可能是不同藥劑的長期施用或混用，造成了藥劑之間的交互抗性或負(fù)交互抗性[20]；或者與芒果炭疽病菌的遺傳分化有關(guān)，而關(guān)于遺傳分化與抗藥性之間的關(guān)系有必要進(jìn)一步深入研究。

通過比較不同分離部位菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性發(fā)現(xiàn)，分離自葉片的菌株能夠代表供試菌株整體情況，在開展抗藥性監(jiān)測(cè)和治理過程中，為便于獲得病原菌，可以采集染病葉片，從而確保監(jiān)測(cè)與治理工作的周年實(shí)施。

比較2011～2013年所采集的菌株對(duì)甲基硫菌靈敏感性的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株對(duì)藥劑的敏感性有所下降，EC50均值增長幅度超過10%，其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)逐年增加，其原因可能是病原菌對(duì)甲基硫菌靈所產(chǎn)生的抗藥性或因苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性所致，此需進(jìn)一步深入研究。

127株菌株中，74.02%菌株的EC50值<平均值0.878 9 μg/mL，而25.98%菌株的EC50值高于平均值，這與葉佳等[8-9]等研究葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）對(duì)甲基硫菌靈的結(jié)果相似。Kumar等[14]報(bào)道分離自印度的芒果炭疽病菌中Cg3菌株對(duì)甲基硫菌靈表現(xiàn)了中度抗藥性；Sanders等[15]研究南非芒果炭疽病菌對(duì)苯并咪唑類的噻菌靈和苯菌靈抗藥性發(fā)現(xiàn)，8.5%、9.2%菌株分別對(duì)噻菌靈或苯菌靈產(chǎn)生中度抗藥性，這些研究結(jié)果都說明了芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性逐漸降低，有產(chǎn)生抗藥性的趨勢(shì)。

為減緩芒果炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈抗藥性的產(chǎn)生，生產(chǎn)上應(yīng)高度重視其抗藥性問題，避免長期單一施用苯并咪唑類藥劑，推薦輪換或混合用藥，加強(qiáng)抗藥性檢測(cè)與治理。芒果炭疽病菌的抗藥性問題是一個(gè)極其復(fù)雜的綜合性問題，本研究只進(jìn)行了室內(nèi)敏感性測(cè)定，仍需對(duì)敏感度低的菌株開展遺傳穩(wěn)定性、紫外誘導(dǎo)抗藥性以及抗藥性分子機(jī)制等方面進(jìn)行研究。

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責(zé)任編輯：古小玲