球孢鏈霉菌JK—1抗菌物質的理化特性研究

李其利 黃穗萍 郭堂勛 莫賤友 黃俊斌

摘要 [目的]明確球孢鏈霉菌JK1抗菌物質的基本理化性質。[方法]以稻瘟菌為指示菌，采用菌絲生長速率法分別測定球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液在不同溫度、不同酸堿度、蛋白酶K處理和硫酸銨鹽析之后的抑菌活性；采用硫酸銨鹽析對抗菌物質進行初步提純，并通過超濾的方法初步測定該抗菌物質的分子量大小。[結果]球孢鏈霉菌JK1產生的抗菌物質在高溫和蛋白酶K處理的情況下抑菌活性顯著降低，在pH2～11條件下抑菌活性無顯著變化，而pH≥11的強堿性條件下抑菌活性顯著降低。飽和度為50%的硫酸銨即可將發(fā)酵液中的抗菌物質完全沉淀下來，超濾發(fā)現(xiàn)其分子量在10～30 kD。[結論]該研究結果為球孢鏈霉菌的田間應用及其抗菌物質的分離鑒定奠定了基礎。

關鍵詞 球孢鏈霉菌；抗菌物質；理化特性

中圖分類號 S432.4+4 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）27-09356-03

Study on Physicochemical Property of Antifungal Substances from Streptomyces globisporus JK1

LI Qili1，2， HUANG Suiping1，2，GUO Tangxun1，2 et al

（1.Institute of Plant Protection，Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007；2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007）

Abstract [Objective] The aim was to understand basical physicochemical property of antifungal substances from S.globisporus JK1.[Method]Antifungal activity against Magnaporthe oryzae was determined after the culture filtrates of S.globisporus JK1 were treated in various temperatures，pH values，proteinase K or ammonium sulfate precipitation，using the mycelial growth rate method.The antifungal substances were purified priliminarily by ammonium sulfate precipitation，and the range of molecular weight of the antifungal substance was determined with ultrafiltration.[Result] The antifungal activity was significantly lower than control after being treated with high temperature，strong alkalinity （pH≥11） or proteinase K.However，no significant difference was observed when it was treated at the pH ranging from 2 to 11.Ammonium sulfate precipitation could be used to purify the antifungal substances preliminarily，and the molecular weight of the antifungal substance was between 10 kD and 30 kD.[Conclusion]The study result provide a basic for field application and further isolation，purification and identification of the antifungal substances.

Key words Streptomyces globisporus；Antifungal substances；Physicochemical property

鏈霉菌是一類具有廣泛實際用途和巨大經濟價值的微生物類群，廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境中，種類繁多，代謝功能各異。在目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬種微生物來源的活性物質中，超過50%的都是來自于鏈霉菌。鏈霉菌可產生種類眾多的農用抗生素，而且大多數(shù)已在農業(yè)生產中廣泛應用，可防治真菌、細菌、線蟲病害以及一些重要害蟲，有的還具有除草活性^[1]。筆者于2007年在培養(yǎng)稻瘟菌的培養(yǎng)皿內發(fā)現(xiàn)了一株對稻瘟病菌有很強拮抗作用的鏈霉菌菌株JK1，通過形態(tài)學觀察、生理生化測定以及16S rDNA序列分析，將其鑒定為球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus），

其發(fā)酵液對多種植物病原菌具有很強的拮抗作用，并且對水稻稻瘟病有較好的防治效果^[2]。

前人的研究主要集中于球孢鏈霉菌及其抗生素的抗腫瘤活性，而很少有關于其對植物病原菌的抗菌活性方面的報道^[3-4]。

然而，球孢鏈霉菌JK1產生的抗菌物質的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性等基本理化性質尚不清楚，而這些性質直接影響著該菌的應用范圍和田間效果，也是進一步分離提純及鑒定其抗菌物質分子結構的基礎。為明確該抗菌物質的基本理化特性，筆者研究了球孢鏈霉菌JK1產生的抗菌物質在不同溫度、酸堿度、蛋白酶K、硫酸銨鹽析等方法處理的情況下其抑菌活性的變化，并采用超濾的方法初步測定了抗菌物質分子量的大小，旨在為進一步分離提純、結構鑒定和開發(fā)利用該抗菌物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 球孢鏈霉菌JK1由湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點實驗室分離培養(yǎng)并獲得。

1.2 方法

1.2.1 球孢鏈霉菌發(fā)酵濾液的理化性質。

1.2.1.1 球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液的制備。

將球孢鏈霉菌JK1劃線接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，參照方中達^[5]的方法）培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫光照下培養(yǎng)6 d后，用接種針挑取少量菌落至盛有100 ml 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液（PSB，參照方中達^[5]的方法）的三角瓶中（250 ml），于25 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)6 d后，將JK1菌體懸浮液（10⁸cfu/ml）按照05%（V/V）的接種量接種到新鮮的PSB培養(yǎng)液中，置于同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 d即為發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心（12 000 r/min，20 min），取上清，用0.45 μm的微孔濾膜真空抽濾后所得濾液即為發(fā)酵濾液。

1.2.1.2 熱穩(wěn)定性。取20 ml發(fā)酵濾液，分別置于25、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120 ℃溫度下處理30 min后，用細菌過濾器過濾后按10%的比例加入到PDA培養(yǎng)基中，以添加未處理的發(fā)酵濾液（4 ℃保存）和不添加發(fā)酵濾液的PDA平板為對照，每處理3次重復。將直徑5 mm的稻瘟菌菌絲塊接種到PDA平板中央，置于25 ℃下培養(yǎng)10 d后測量菌落直徑。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.1.3 酸堿穩(wěn)定性。取20 ml發(fā)酵濾液，分別用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH將樣品pH調節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，室溫下放置24 h后，按照“1.2.1.2”方法測定各處理發(fā)酵濾液的抑菌活性，每個處理3次重復。

1.2.1.4 蛋白酶K處理對發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

取20 ml發(fā)酵濾液，加入蛋白酶K使其終濃度為100 μg/ml，置于37 ℃下分別水浴30、60、90、120 min后，按照“1.2.1.2”方法測定各處理發(fā)酵濾液的抑菌活性，以未添加蛋白酶K的發(fā)酵濾液為對照。

1.2.1.5 硫酸銨鹽析后不同組分的抑菌活性測定。

（1）硫酸銨鹽析。取20 ml發(fā)酵濾液，加入固體硫酸銨至飽和度（M/V）分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。4 ℃靜置過夜后，10 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀物，并置于4 ℃冰箱內用0.02 mol/L磷酸緩沖液透析48 h測定抑菌活性。

（2）抑菌活性測定。將滅菌的濾紙片（直徑5 mm）置于涂有稻瘟菌孢子液的PDA平板上（直徑15 cm），無菌風吹干至培養(yǎng)基表面無明顯水分。然后將不同處理的沉淀透析液和上清透析液用孔徑為0.45 μm的細菌過濾器過濾，分別用微量移液器添加至濾紙片上，每片20 μl。以在濾紙片上添加等量的未處理粗提物、相同硫酸銨飽和度鹽析處理的PSB培養(yǎng)液和磷酸緩沖液為對照，每個處理設3個重復。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 d后測量抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌物質粗提物的基本性質。

1.2.2.1 抗菌物質粗提物的制備。

將“1.2.1.1”所述發(fā)酵濾液用飽和度為80%的硫酸銨4 ℃沉淀過夜，于 4 ℃、10 000 r/min離心30 min收集沉淀。將沉淀用發(fā)酵濾液1%體積的0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.8）溶解，置于4 ℃冰箱內用0.02 mol/L磷酸緩沖液透析48 h，冷凍干燥后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 熱穩(wěn)定性。

將粗提物溶解于0.02 mol/L磷酸緩沖液中配制成濃度為10 mg/ml的溶液，取1 ml溶液分別置于40、50、60、70、80、90、100、110、120 ℃溫度下處理30 min，以未處理的粗提物和磷酸緩沖液為對照，每個處理3次重復。按照“1.2.1.5”方法測定不同溫度處理粗提物對稻瘟菌的抑菌活性。

1.2.2.3 蛋白酶K對粗提物抑菌活性的影響。

取磷酸緩沖液溶解的粗提物（10 mg/ml）1 ml，添加蛋白酶K至終濃度為100 μg/ml，置于37 ℃下分別水浴30、60、90、120 min，細菌過濾器過濾后按照“1.2.1.5”方法測定各處理粗提物對稻瘟病菌的抑菌活性，以未處理的粗提物和磷酸緩沖液為對照，每個處理3次重復。

1.2.2.4 抗菌物質分子量的初步測定。

取磷酸緩沖液溶解的粗提物（10 mg/ml）各15 ml，分別加入截留分子量為10 和30 kD的超濾離心管中（Millipore，裝量15 ml），在5 000 r/min、4 ℃下離心15 min，分別收集過濾液與殘留物，并按照“1.2.1.5”方法測定各處理濾液和殘留物對稻瘟菌的抑菌活性。以未過濾的發(fā)酵濾液和磷酸緩沖液為對照，每處理重復3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。用DPS3.01專業(yè)版軟件分析不同溫度、pH、蛋白酶K、硫酸銨沉淀、超濾對球孢鏈霉菌JK1產生抗菌物質抑菌活性的影響，百分率數(shù)據(jù)轉換成反正弦值并用最小顯著差數(shù)法（LSD）比較不同處理的差異顯著性。用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液的理化性質

2.1.1 熱穩(wěn)定性。

結果表明，發(fā)酵濾液在4～30 ℃溫度下處理30 min其抑菌活性差異不顯著（圖1）。高于40 ℃的溫度處理其抑菌活性與對照相比顯著降低。在120 ℃溫度下處理30 min，其抑菌活性雖與對照相比顯著降低，但是發(fā)酵濾液仍然具有明顯的抑菌活性，抑菌率可達58%。

3 結論與討論

前人研究表明，球孢鏈霉菌在低溫（≤15 ℃）培養(yǎng)的情況下可產生一類多肽類抗生素——冷霉素，并且發(fā)現(xiàn)最適于冷霉素產生的溫度是12 ℃^[6-7]。在中等溫度下（15～30 ℃），球孢鏈霉菌可產生水溶性的抗生素——力達霉素、M81和溶菌酶等^[7-9]。對球孢鏈霉菌JK1產生的抗菌物質的穩(wěn)定性研究結果表明，其產生的抗菌物質在高于40 ℃的溫度下處理或蛋白酶K處理的情況下其抑菌活性均呈下降趨勢，且可被硫酸完全沉淀下來，說明該抗菌物質為蛋白類抗生素，可通過硫酸銨鹽析進行初步提純。抗菌物質在酸性和中性條件下穩(wěn)定，而在強堿性條件下（pH≥11）活性顯著降低。超濾的結果表明，JK1產生的抗菌物質的分子量在10～30 kD。這與前人報道的球孢鏈霉菌產生的蛋白類抗生素力達霉素的分子量（15 kD）較接近。然而，前人的研究多集中于球孢鏈霉菌產生抗腫瘤活性的抗生素方面，而對其產生的對植物病害有較好防治效果的抗菌物質的研究較少[3，10]。筆者初步研究了球孢鏈霉菌產生的對多種植物病原菌有拮抗作用的抗菌物質的理化特性，為該菌的田間應用提供了理論依據(jù)，同時也為分離鑒定其抗菌物質的分子結構奠定了基礎。

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