烯唑醇·苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的急性和聯(lián)合毒性

郭賽男 童美玲 陳文君 邵偉偉 林植華 韋力

摘要 [目的]了解3種殺菌劑對水生生物的急性和聯(lián)合毒性。[方法]采用靜態(tài)換水方法研究了烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺錳鹽3種殺菌劑對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性及其聯(lián)合毒性，并對其進行了安全性評價。[結(jié)果]在急性毒性試驗中，烯唑醇在24、48和72 h的半致死濃度（LC50）分別為60.80、62.40和41.20 mg/L；苯醚甲環(huán)唑的LC50分別為11.50、10.40和9.00 mg/L；咪鮮胺錳鹽的LC50分別為4930、6.40和3.00 mg/L；烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的安全濃度（SC）分別為19.90、2.50和0.03 mg/L。在聯(lián)合毒性試驗中，烯唑醇+苯醚甲環(huán)唑的聯(lián)合毒性和咪鮮胺錳鹽+苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用，咪鮮胺錳鹽+烯唑醇聯(lián)合組中除了0.6U+0.4U毒性比組均表現(xiàn)為協(xié)同作用外，其他3個毒性比組均表現(xiàn)為拮抗作用。[結(jié)論]為進一步了解農(nóng)藥對兩棲類的毒性影響以及農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的合理使用提供了參考。

關(guān)鍵詞 烯唑醇；苯醚甲環(huán)唑；咪鮮胺錳鹽；急性毒性；聯(lián)合毒性；飾紋姬蛙；蝌蚪

中圖分類號 S189 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-09350-04

Acute and Joint Toxicity of Diniconazole， Difenoconazole and Prochlorazmanganese Chloride Complex to Microhyla ornata Tadpoles

GUO Sainan， TONG Meiling， CHEN Wenjun， WEI Li* et al

（College of Ecology， Lishui University， Lishui， Zhejiang 323000）

Abstract [Objective]The aim was to understand acute and joint toxicity of three fungicides against aquatic organisms. [Method] Used Microhyla ornata tadpoles as experimental model， the acute toxicity， jonit toxicity and safety evaluation of three different pesticides （diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex） were studied by the method of stability water tests. [Result] In acute toxicity test， the LC50 of diniconazole examined at 24， 48 and 72 h were 60.80， 62.40 and 41.20 mg/L， respectively， whereas those of difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex were 11.50， 10.40， 9.00 mg/L and 49.30， 6.40 and 3.00 mg/L， respectively. The SC of diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex to M. ornata tadpoles were 19.90， 2.50 and 0.03 mg/L， respectively. Among the pairwise combinations of the three pesticides， the toxicity of diniconazole+difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex+difenoconazole combinations showed synergistic. For the joint toxicity of prochlorazmanganese chloride complex+diniconazole combination， except 0.6U+0.4U combination showed synergistic， the other treatments showed antagonistic. [Conclusion] The results provide valuable information on the toxic effects of pesticides on amphibians and how various types of pesticides can be reasonably used in agricultural areas.

Key words Diniconazole； Difenoconazole； Prochlorazmanganese chloride complex； Acute toxicity； Joint toxicity； Microhyla ornata； Tadpoles

兩棲類是生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的成員，既能影響營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，也可作為許多物種的高質(zhì)量獵物^[1]。近20年來，科學(xué)家找到了加速全球兩棲類衰退的大量證據(jù)^[2-3]。兩棲類易受農(nóng)業(yè)污染物的威脅，因為它們有滲透性的皮膚和卵，易從環(huán)境吸收化學(xué)污染物，大多數(shù)兩棲類的生活史在農(nóng)藥使用區(qū)域完成，其胚胎易受污染物危害，其幼體發(fā)育時間與農(nóng)藥使用時間一致，因此對污染物極敏感^[4]。

幾十年來隨著農(nóng)藥使用的不斷增多，其對兩棲類動物的生態(tài)影響也越來越多^[5-7]。農(nóng)藥具有影響許多水生生物類群的潛力，人們對兩棲動物的影響在過去幾十年里尤為關(guān)注，因為許多物種在全球有明顯的衰退現(xiàn)象[2-3，8]。據(jù)報道，全球兩棲類種群衰退的最大原因是環(huán)境問題^[9]，農(nóng)藥化學(xué)品排放到自然環(huán)境經(jīng)常導(dǎo)致生境惡化及局部兩棲類動物種群的滅絕。然而，在我國大部分地區(qū)，農(nóng)藥使用仍然十分普遍，每年有很大農(nóng)藥劑量流入環(huán)境或水體中，造成不同程度的污染。因此，以兩棲類作為生物指示劑對環(huán)境污染物進行監(jiān)測是十分有效的方法。

飾紋姬蛙（Microhyla ornata）是無尾兩棲類最小的物種之一，廣泛分布于我國西北、華中、華南、華東和西南地區(qū)，常在田邊、臨時性水塘及其附近草叢中活動和捕食^[10]。筆者研究了3種農(nóng)藥殺菌劑（烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽）對飾紋姬蛙蝌蚪的急性及其聯(lián)合毒性，旨在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)合理使用農(nóng)藥、保護飾紋姬蛙及其他兩棲類動物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物。

于麗水學(xué)院校園內(nèi)水洼中撈取飾紋姬蛙卵團，帶回實驗室，置于60 cm ×40 cm× 30 cm的塑料箱內(nèi)，加入曝氣水20 cm，自然條件下孵化。孵化后用水藻喂食蝌蚪。7日齡時，挑選大小均一[體長（5.023±0.065）mm，體重（0.010±0.002）g]、健康活潑的蝌蚪供試驗用。

1.1.2 供試藥劑。

烯唑醇（WP，12.5%）和咪鮮胺錳鹽（WP，50%）均為江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；苯醚甲環(huán)唑（EC，250 g/L）為廣東省江門市植保有限公司生產(chǎn)。試驗前，統(tǒng)一配制好每一種農(nóng)藥的原液濃度：烯唑醇為1 000.0 mg/L，咪鮮胺錳鹽和苯醚甲環(huán)唑均為100.0 mg/L。試液在試驗前用干凈的曝氣水進行稀釋。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗。

參考Wei等的試驗結(jié)果^[11]，采用“靜態(tài)-換水式”的毒性試驗方法^[12]。將烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺錳鹽分別按0.035、0.045和0.150的等對數(shù)間距設(shè)計5個濃度試驗組（烯唑醇：40.0、43.0、46.8、50.7、55.0 mg/L；苯醚甲環(huán)唑：8.0、8.8、9.8、10.8、12.0 mg/L；咪鮮胺錳鹽：2.0、2.8、4.0、5.6、8.0 mg/L），并另設(shè)一個空白對照組，每個試驗組設(shè)置3個平行。試驗使用容積為1 L的塑料圓盒，各組試驗藥水為500 ml，每個盒子放10尾蝌蚪，整個試驗在室溫下進行。在毒性試驗期間，不投食，每24 h更換一次試液。記錄24、48和72 h飾紋姬蛙蝌蚪的死亡數(shù)。判斷蝌蚪死亡的標準是用鑷子輕夾蝌蚪的尾部，若無反應(yīng)，即認為蝌蚪已死亡[11，13]。

1.2.2 聯(lián)合毒性試驗。

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，計算出每種農(nóng)藥在不同染毒時間的LC50，以每種農(nóng)藥在48 h的LC50值作為一個毒性單位（U），分別按比例（表1）進行3種農(nóng)藥兩兩聯(lián)合，進行聯(lián)合毒性試驗^[14]，每組試驗設(shè)置3個平行組，并設(shè)1個對照組。結(jié)果觀察和記錄方法與“1.2.1”相同。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。

1.2.3.1 農(nóng)藥濃度對蝌蚪死亡率的影響比較。

單一農(nóng)藥的不同濃度在相同染毒時間內(nèi)對蝌蚪死亡率的影響，分別采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukeys多重比較對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。統(tǒng)計前，先對同一染毒時間內(nèi)的不同農(nóng)藥濃度試驗組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。為進一步確定每種農(nóng)藥不同濃度、不同染毒時間以及兩者的交互作用對蝌蚪死亡率的影響，采用重復(fù)檢驗方差分析（Repeated measures ANOVA）進行統(tǒng)計。用Statistica 6.0軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)均以平均值表示。

1.2.3.2 LC50和SC。

參照概率單位法求得各污染物對飾紋姬蛙的24、48和72 h的LC50^[14]。采用經(jīng)典公式（48 h LC50×0.3）/（24 h LC50/48 h LC50）²計算SC^[15]。最后，根據(jù)國家環(huán)境保護局對化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則，將農(nóng)藥對蝌蚪的毒性劃分為3個等級：LC50>10.0 mg/L為低毒；LC50=1.0～10.0 mg/L為中等毒性；LC50<1.0 mg/L為劇毒^[12]。

1.2.3.3 聯(lián)合毒性評價。

根據(jù)48 h各試驗組飾紋姬蛙蝌蚪的死亡數(shù)，繪制濃度死亡曲線分析確定各毒性比之間聯(lián)合作用類型。毒性比試驗組的死亡率大于50%，為協(xié)同作用；若小于50%，則為拮抗作用^[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一農(nóng)藥對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性

由表2可知，3種農(nóng)藥單獨作用于飾紋姬蛙蝌蚪時，在相同染毒時間內(nèi)（24、48、72 h），其死亡率均有所不同，且不同濃度試驗組之間的死亡率比較均呈顯著性差異。烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽的LC50均隨染毒時間的增加而降低（表3），且各自的SC分別為19.90、2.50和0.03 mg/L。根據(jù)農(nóng)藥對水生生物的毒性等級的劃分，烯唑醇為低毒性農(nóng)藥，苯醚甲環(huán)唑為中等毒性農(nóng)藥，咪鮮胺錳鹽為劇毒性農(nóng)藥。

重復(fù)測量檢驗法統(tǒng)計結(jié)果表明，在3個試驗組中，不同農(nóng)藥濃度和染毒時間均分別對飾紋姬蛙蝌蚪的死亡率影響顯著。同時，在兩者的交互作用時，所有試驗組對蝌蚪死亡率的影響均顯著（表4）。

2.2 3種農(nóng)藥對飾紋姬蛙蝌蚪的聯(lián)合毒性

單因素方差分析結(jié)果表明，烯唑醇+苯醚甲環(huán)唑聯(lián)合試驗組中的不同毒性

比對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率的影響差異顯著（df3，8=11.485，

烯唑醇是一種高效、廣譜殺菌劑，對植物的生長調(diào)節(jié)、生理活性產(chǎn)生影響。目前，烯唑醇主要用于植物病害防治^[16-17]。如趙莉等研究表明烯唑醇對麥蚜蟲的LC50為1.603 0×1012 μg/ml^[18]，為低毒性農(nóng)藥。該研究表明，烯唑醇在不同的染毒時間（24、48和72 h）對飾紋姬蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)不同，LC50隨染毒時間的延長而降低，SC為19.90 mg/L，也屬于低毒性農(nóng)藥。不同濃度、不同染毒時間及其兩者的交互作用均對飾紋姬蛙的死亡率影響顯著。

苯醚甲環(huán)唑具有殺菌譜廣、高效、安全的特點，自2003年以來在全世界農(nóng)藥市場中一直銷售量很高，是未來殺菌劑的主流品種之一。該農(nóng)藥可高效防治銹病、炭疽病、黑斑病、葉枯病、早疫病、瘡痂病、白粉病、莖枯病、斑點落葉病、紫斑病等多種病害。秦紹源等發(fā)現(xiàn)10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對柑橘黑點病進行防治，發(fā)現(xiàn)其抑菌濃度（EC50）為0.102 μg/L^[19]。馬雪楠等研究發(fā)現(xiàn)30%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對蘋果樹褐斑病有較好的防治效果，其5 000倍液的防治效果達到90.96%^[20]。該研究中的苯醚甲環(huán)唑?qū)︼椉y姬蛙蝌蚪的毒性也較大，24、48和72 h的LC50分別為11.50、10.40和9.00 mg/L，SC為2.50 mg/L，該農(nóng)藥的不同濃度、染毒時間及其兩者的交互作用均對飾紋姬蛙蝌蚪的死亡率影響顯著。

咪鮮胺錳鹽是咪唑類廣譜性殺菌劑，其有效成分為咪鮮胺、氯化錳復(fù)合物，具有保護和鏟除雙重作用，可高效防治花葉病、腐爛病、炭疽病、白粉病、青霉病等。蔡美蘭利用50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑防治芒果炭疽病，發(fā)現(xiàn)1 000～2 000倍液對芒果炭疽病具有明顯的防治效果^[21]。秦紹源等利用50%咪鮮胺錳鹽可濕粉對柑橘黑點病進行防治，EC50為0186 μg/L^[19]。該研究中咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的毒性作用為劇毒性，24、48和72 h的LC50分別為49.30、6.40和3.00 mg/L，SC為0.03 mg/L，其濃度、染毒時間及其相互作用均對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率影響顯著。

在3種農(nóng)藥的兩兩聯(lián)合毒性試驗中發(fā)現(xiàn)烯唑醇與苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環(huán)唑的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用，而咪鮮胺錳鹽+烯唑醇聯(lián)合組中除了0.6U+0.4U毒性比組表現(xiàn)為協(xié)同作用外，其他3個毒性比組均表現(xiàn)為拮抗作用。因此，飾紋姬蛙在面對3種單一農(nóng)藥及其聯(lián)合毒性作用時，響應(yīng)機制可能較復(fù)雜，這可能與物種和發(fā)育歷期、農(nóng)藥染毒的持續(xù)時間和強度有關(guān)^[22]。

該研究報道了烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽3種農(nóng)藥對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性效應(yīng)，每種農(nóng)藥的不同濃度及染毒時間，以及農(nóng)藥的兩兩聯(lián)合作用均對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率產(chǎn)生顯著影響。該研究結(jié)果可用于烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺錳鹽毒性的監(jiān)督管理以及我國水體區(qū)域的生態(tài)監(jiān)測。

參考文獻

[1] SAYIM F.Acute toxic effects of malathion on the 21st stage larvae of the marsh frog[J].Turkish J Zool，2008，32（1）：99-106.

[2] KIESECKER J M，BLAUSTEIN A R，BELDEN L K.Complex causes of amphibian population declines[J].Nature，2001，410：681-684.

[3] HOULIHAN J E，F(xiàn)RIDLAY C S，SCHMIDT B R，et al.Quantitative evidence for global amphibian population declines[J].Nature，2001，404：752-755.

[4] HAYES T，HASTON K，TSUI M，et al.Atrazine induced hermorphropdism at 01 ppb in American leopard frogs（Rana pipiens）laboratory and field evidence[J].Environ Heal Persp，2003，111：568-575.

[5] HALL R J，HENRY P F P.Review assessing effects of pesticides on amphibians and reptiles status and needs[J].Herpertol J，1992，2：65-67.

[6] STUART S N，CHANSON J S，COX N A，et al.Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide[J].Science，2004，306（5702）：1783-1786.

[7] JAYAWARDENA U A，NAVARATNE A N，AMERASINGHE P H，et al.Acute and chronic toxicity of four commonly used agricultural pesticides on the Asian common toad，Bufo melanostictus Schneider[J].J Natn Sci Foundation Sri Lanka，2011，39（3）：267-276.

[8] EZEMONYE L I N，TONGO I.Lethal and sublethal effects of atrazine to amphibian larvae[J].Jordan J Biol Sci，2009，2（1）：29-36.

[9] VERTUCCI F A，CORN P S.Evaluation of episodic acidification and amphibian declines in the Rocky Mountains[J].Ecol Appl，1996，61：449-457.

[10] FEI L，HU S Q，YE C Y，et al.Fauna Sinica Amphibia，Vol.2，Anura[M].Beijing：Science Press，2009.

[11] WEI L，SHAO W W，DING G H，et al.Acute and joint toxicity of three agrochemicals to Chinese tiger frog（Hoplobatrachus chinensis）tadpoles[J].Zool Res，2014，35（4）：272-279.

[12] 周永欣，章宗涉.水生生物的毒性試驗方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[13] 薛清清，姚丹，黃澤宇，等.殺蟲劑敵敵畏和除草劑丁草胺對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性試驗[J].四川動物，2005，24（2）：209-212.

[14] 陳娜，郝家勝，王瑩，等.銅、鉛、鎘、鋅、汞和銀離子復(fù)合污染對水螅的急性毒性效應(yīng)[J].生物學(xué)雜志，2007，24（3）：32-35.

[15] 張云龍，袁娟，陳麗萍，等.三種重金屬對鯽魚苗的急性毒性和聯(lián)合毒性試驗[J].河北漁業(yè)，2011（2）：24-27.

[16] 馬葉，張春冬.5%烯唑醇微乳劑防治香蕉褐緣灰斑病的田間藥效試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（19）：3967-3968.

[17] 馬登萍.三唑酮和烯唑醇防治楊樹銹病田間藥效試驗[J].北方園藝，2012（19）：157-158.

[18] 趙莉，魏紅濤，王沫.啶蟲咪、烯唑醇及其混劑對麥蚜聯(lián)合毒力作用研究[J].湖北植保，2001（4）：5-7.

[19] 秦紹源，周小燕，姜于蘭.防治柑橘黑點病室內(nèi)殺菌劑篩選試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：77-79.

[20] 馬雪楠，鄭敬敏，王小見.苯醚甲環(huán)唑防治蘋果樹褐斑病藥效試驗[J].西北園藝：果樹，2012（3）：45.

[21] 蔡美蘭.50%咪鮮胺錳鹽可濕粉對芒果炭疽病的防治效果[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2008，4（3）：206-207.

[22] BERRILL M，BERTHAM S，WILSON A，et al.Lethal and sublethal impacts of insecticides on amphibian embryos and tadpoles[J].Environ Toxicol Chem，1993，12（3）：525-539.