Polycomb家族基因獴mSu（z）12在家蠶幼蟲中的表達(dá)研究

邢秋婷 郭興國 邢萬靜 闞云超 喬惠麗

摘要 [目的] 研究家蠶Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蠶幼蟲中的表達(dá)情況。[方法] 根據(jù)家蠶基因組預(yù)測的BmSu（z）12基因序列，設(shè)計特異引物，利用qRTPCR對該基因在家蠶不同齡期幼蟲中的表達(dá)進行研究。[結(jié)果] BmSu（z）12基因在5齡幼蟲蛻皮后2 d和變態(tài)前2 d有較高表達(dá)，而在1～5齡取食中期表達(dá)量較低，表達(dá)特征具有一定的規(guī)律性。 [結(jié)論] BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲生長發(fā)育中具有重要作用，該研究為進一步研究家蠶SU（Z）12蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 家蠶；polycomb蛋白；Su（z）12基因；表達(dá)

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-09286-02

Study on Expression of Polycomb Group Gene BmSu（z）12 in Silkworm Larvae.

XING Qiuting， GUO Xingguo， XING Wanjing， QIAO Huili et al

（Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061）

Abstract [Objective] The aim was to study the expression of polycomb group gene BmSu（z）12， in silkworm larvae. [Method] Based on the predicted BmSu（z）12 gene sequence in the genome of silkworm， the specific primers were designed. qRTPCR was applied to analyze the expression of BmSu（z）12 in different instar larvae of silkworm. [Result] The expression level of BmSu（z）12 was high in the first and the last 2 days of the 5th newly molted larvae， low expression was observed in the eating larvae of each instar. It showed regular expression patterns in the different developmental stages of larva. [Conclusion] BmSu（z）12 may have important roles in the development of the silkworm larvae， the study will provide fundamental knowledge for further investigation of SU（Z）12 protein function in silkworm.

Key words Silkworm； Polycomb protein； Su（z）12 gene； Expression

Polycomb蛋白復(fù)合體（Polycomb Group Proteins，PcG）是通過對組蛋白進行甲基化修飾來調(diào)控靶基因的表觀遺傳調(diào)控因子，廣泛存在于果蠅、線蟲、小鼠、人和擬南芥等各種生物體中，在進化上高度保守。PcG蛋白家族最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，主要包含2個核心蛋白復(fù)合體，即PRC1（Polycomb Repressive Complex 1）和PRC2（Polycomb Repressive Complex 2），其中PRC2在轉(zhuǎn)錄抑制起始階段發(fā)揮作用，PRC1主要維持處于阻抑狀態(tài)染色質(zhì)的穩(wěn)定性^[1-4]。

在果蠅中，PRC1是由PC、PH、PSC和dRing組成的一個蛋白復(fù)合體，PRC2主要包括ESC、E（Z）、Rpd3、SU（Z）12和組蛋白結(jié)合蛋白p55/RbAp48^[5-6]。在哺乳動物中，PRC1由HPC、HPH、Bmi1/Mel18和Ring1A/B組成，PRC2由EED、EZH2、SU（Z）12、RbAp48和AEBP2組成，其中PRC2催化核心組蛋白的甲基化，而甲基化的組蛋白為PRC1復(fù)合體識別和結(jié)合提供位點^[7]。

近年來，PcG蛋白作為轉(zhuǎn)錄水平上的表觀遺傳修飾因子和細(xì)胞命運的調(diào)節(jié)子受到越來越多研究者的關(guān)注。在生物生長發(fā)育和病變過程中，PcG蛋白通過形成多復(fù)合體，作用于染色體上的不同位點，致使染色體變構(gòu)，以期調(diào)控基因表達(dá)^[8]。PcG蛋白的主要作用靶標(biāo)是Hox基因簇，Hox基因在決定細(xì)胞的定向分化與增殖、調(diào)控機體組織器官發(fā)育方面起決定性作用。其中PRC2主要參與H3K27的甲基化修飾來抑制靶基因的表達(dá)，而SU（Z）12是PRC2蛋白復(fù)合體發(fā)揮其內(nèi)在的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferase，HMTase）活性所必需的成分之一，其VEFS結(jié)構(gòu)域在果蠅、人和擬南芥中高度保守，目前發(fā)現(xiàn)SU（Z）12在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控中起著極其重要的作用^[9-12]。

家蠶作為人類最早馴化的動物之一，是我國重要的特色經(jīng)濟昆蟲，且作為鱗翅目昆蟲的模式生物，在研究昆蟲變態(tài)發(fā)育及農(nóng)林業(yè)害蟲防治中也發(fā)揮著重要作用，同時家蠶具有大量的Hox基因。筆者根據(jù)家蠶基因組中預(yù)測的BmSu（z）12基因序列，利用PCR法對家蠶BmSu（z）12基因VEFS結(jié)構(gòu)域進行克隆，并利用qRTPCR研究BmSu（z）12在家蠶不同齡期幼蟲的表達(dá)情況，從而為進一步研究家蠶中BmSu（z）12的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以家蠶品種大造P50作為試驗材料，用新鮮的桑葉飼養(yǎng)。分別取1～4齡幼蟲和5齡每天的整蠶，解剖去中腸并用DEPC水沖洗。所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物

PCR擴增所用引物序列（5′～3′）BmSu（z）12F：GAGTTCCTAGAGCTGGACGA；

BmSu（z）12R：GAGCATCTGAACGGTCT；

BmactinA3F：ATGTGCGACGAAGAAGTTGC；

BmactinA3R：GTCTCCTACGTACGAGTCCT。由奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 家蠶幼蟲RNA提取及BmSu（z）12基因克隆

采用Trizol（Invitrogen）法，提取家蠶幼蟲整蠶樣品RNA，利用PrimeScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行后續(xù)試驗。

根據(jù)家蠶基因組中預(yù)測的BmSu（z）12基因序列BGIBMGA011842PA設(shè)計引物。以家蠶5齡第1天幼蟲cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。將純化后的擴增產(chǎn)物與pMD19T simple連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）DH5α，挑取陽性克隆，進行測序驗證。

1.4 BmSu（z）12基因在不同齡期幼蟲中表達(dá)的qRTPCR分析

qRTPCR檢測的內(nèi)參基因為家蠶BmactinA3（GenBank登錄號：U49854）。BmactinA3和BmSu（z）12引物序列見“1.2”。反應(yīng)檢測儀為BioRad 公司的CFX96系統(tǒng)，qRTPCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，溶解曲線在65 ～95 ℃用來判定產(chǎn)物特異性。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，BmSu（z）12基因mRNA的相對表達(dá)量用2-△CT表示，其中△Ct=Ct（目的基因）- Ct（內(nèi)參基因）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSu（z）12基因片段的克隆

通過PCR方法，從家蠶幼蟲RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA中克隆BmSu（z）12基因423 bp的片段，產(chǎn)物經(jīng)奧科公司測序正確，表明為目的基因。

2.2 BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲不同時期的表達(dá)分析

采用qRTPCR方法對BmSu（z）12在家蠶不同齡期幼蟲的表達(dá)情況進行定量檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，BmSu（z）12基因在家蠶1～4齡的幼蟲中表達(dá)量較低，而在5齡各時期樣品中的表達(dá)量相對較高，并呈一定的規(guī)律。在剛蛻皮后的5齡第1天、第2天和進入變態(tài)前的5齡第7天、第8天表達(dá)量較高，而在5齡中期（第3、4、5、6天）的表達(dá)量較低。

3 討論

PcG蛋白家族通過催化組蛋白H3的27位賴氨酸的甲基化水平來調(diào)控靶基因表達(dá)，并廣泛參與到發(fā)育、增殖、分化及腫瘤發(fā)生等重要的生命過程。SU（Z）12本身沒有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但其對PRC2復(fù)合體的功能具有重要作用。研究表明，在過表達(dá)SU（Z）12的果蠅突變體中可以檢測到H3K27me3的甲基化程度明顯增加，而敲除SU（Z）12的突變體中H3K27me3完全消失^[13]。該試驗在家蠶幼蟲中克隆獲得PcG蛋白PRC2復(fù)合體中的重要組分BmSu（z）12基因的VEFS結(jié)構(gòu)域，將其編碼氨基酸序列與其他物種的同源序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其與果蠅和人類Su（z）12分別有72%和52%的序列相似性。BmSu（z）12家蠶幼蟲的qRT PCR結(jié)果顯示，BmSu（z）12基因在5齡幼蟲中蛻皮后2 d和變態(tài)前2 d表達(dá)量較高，而在1～5齡取食中期表達(dá)量較低，該表達(dá)特征具有一定的規(guī)律性。因為在幼蟲蛻皮后和變態(tài)前家蠶各組織都處于組織重構(gòu)狀態(tài)，新的組織細(xì)胞將準(zhǔn)備進行分化；而到取食中期，家蠶體內(nèi)組織功能回歸正常，分化過程放緩，表明BmSu（z）12基因在家蠶幼蟲生長發(fā)育中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅SU（Z）12突變體中發(fā)現(xiàn)果蠅產(chǎn)下的卵不能正常發(fā)育^[13]；家蠶中Su（z）12在胚胎發(fā)育早期大量表達(dá)，晚期逐漸降低^[14]，表明該蛋白在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮功能；在哺乳動物細(xì)胞中敲除SU（Z）12后導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變小，進一步表明SU（Z）12可能在細(xì)胞分化中發(fā)揮作用^[15]；最近的研究發(fā)現(xiàn)，Su（z）12在不同人類腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，因此可能是一種新的腫瘤基因治療的分子靶點^[16-18]。家蠶屬于完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，幼蟲期每個齡期之間都要經(jīng)歷眠和蛻皮的過程，不同階段發(fā)育過程中細(xì)胞的重組和分化都非常重要。因此通過對BmSu（z）12在幼蟲中表達(dá)特征的研究，將為進一步研究家蠶SU（Z）12蛋白的功能提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1] MULLER J，HART C M，F(xiàn)RANCIS N J，et al.Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex [J].Cell，2002，111（2）：197-208.

[2] SHAO Z，RAIBLE F，MOLLAAGHABABA R，et al.Stabilization of chromatin structure by PRC1，a Polycomb complex [J].Cell，1999，98（1）：37-46.

[3] BROWN J L，MUCCI D，WHITELEY M，et al.The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1 [J].Mol Cell，1998，1（7）：1057-1064.

[4] KONUMA T，OGURO H，IWAMA A.Role of the polycomb group proteins in hematopoietic stem cells [J].Dev Growth Differ，2010，52（6）：505-516.

[5] OTTE A P，KWAKS T H.Gene repression by polycomb group protein complexes：a distinct complex for every occasion [J]. Curr Opin Genet Dev，2003，13（5）：448-454.

[6] SCHWARTZ Y B，PIRROTTA V.Polycomb complexes and epigenetic states [J].Curr Opin Cell Biol，2008，20（3）：266-273.

[7] HERNANDEZMUNOZ I，TAGHAVI P，KUIJL C，et al.Association of BMI1 with polycomb bodies is dynamic and requires PRC2/EZH2 and the maintenance DNA methyltransferase DNMT1 [J].Mol Cell Biol，2005，25：11047-11058.

[8] GIL J，BERNARD D，PETERS G.Role of polycomb group proteins in stem cells elf2 renewal and cancer [J].DNA Cell Biol，2005，24：117-125.

[9] BRAKEN A P，HELIN K.Polycomb group proteins：navigators of lineage pathways led a stray in cancer [J].Nat Rev Cancer，2009，9（11）：773-784.

[10] OKTABA K，GUTIERREZ L，GAGNEUR J，et al.Dynamic regulation by Polycomb group protein complexes controls pattern formation and the cell cycle in Drosophila [J].Dev Cell，2008，15（6）：877-889.

[11] PLATH K，F(xiàn)ANG J，MLYNARCZYKEVANS S K，et al.Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation [J].Science，2003，300（5616）：131-135.

[12] MAGER J，MONTGOMERY N D，DE VILLENA F P，et al.Genome imprinting regulated by the mouse Polycomb group protein [J].Eed Nat Genet，2003，33（4）：502-507.

[13] CHEN S，BIRVE A，RASMUSONLESTANDER A.In vivo analysis of Drosophila SU（Z）12 function [J].Mol Genet Genomics，2008，279（2）：159-170.

[14] LI Z，TATSUKE T，SAKASHITA K，ZHU L，et al.Identification and characterization of Polycomb group genes in the silkworm，Bombyx mori[J].Mol Biol Rep，2012，39（5）：5575-5588.

[15] CAO R，ZHANG Y.SUZ12 is required for both the histone methyltransferase activity and the silencing function of the EEDEZH2 complex [J].Mol Cell，2004，15（1）：57-67.

[16] LI H，CAI Q，WU H，et al.SUZ12 promotes human epithelial ovarian cancer by suppressing apoptosis via silencing HRK [J].Mol Cancer Res，2012，10（11）：1462-1472.

[17] SATO T，KANEDA A，TSUJI S，et al.PRC2 overexpression and PRC2target gene repression relating to poorer prognosis in small cell lung cancer [J].Sci Rep，2013，3：1911.

[18] KIRMIZIS A，BARTLEY S M，F(xiàn)ARNHAM P J.Identification of the Polycomb Group Protein SU（Z）12 as a potential molecular target for human cancer therapy [J].Mol Cancer Ther，2003，2（1）：113-121.