正交優(yōu)化芒果SRAP擴(kuò)增體系及引物篩選

應(yīng)東山等

摘 要 利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)芒果SRAP-PCR反應(yīng)的5因素（Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物和Taq DNA聚合酶）4水平的擴(kuò)增效果進(jìn)行研究，確立適合芒果SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系?？傮w積25 μL的SRAP-PCR優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系中含有：并運(yùn)用該體系從153對(duì)引物組合中初步篩選出50對(duì)SRAP引物組合。建立的SRAP標(biāo)記可為芒果遺傳多樣性、分子標(biāo)記及輔助育種等提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 芒果；SRAP；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Optimized Conditions of Sequence-related Amplified

Polymorphism（SRAP） System and Primer

Screening for Mango

YING Dongshan， LUO Haiyan， WANG Ming， LI Liping，

WANG Qinfei， ZHU Min， CHEN Yeyuan*

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An orthogonal design was used to optimize the SRAP amplification system including five factors（the concentration of Mg2+， dNTPs， template DNA， primer and Taq DNA polymerase）at four levels for mango. The optimum SRAP-PCR system was established，namely 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×buffer、20 ng template DNA， 2.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmo1/L Primer， 1.5 U Taq DNA polymerase. Under the optimum reaction conditions， 50 out of 153 SRAP primer combinations were selected. The results also indicated that the optimized conditions of SRAP could provide an effective means for the research of genetic diversity， molecular marker and auxiliary breeding in mango.

Key words Mango；SRAP；Orthogonal design；Optimization system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.015

近年來，分子標(biāo)記分析技術(shù)在果樹種質(zhì)資源遺傳差異分析和種質(zhì)資源研究中得到廣泛應(yīng)用。利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳學(xué)研究是理解遺傳傳遞的強(qiáng)有力的途徑，分子標(biāo)記所揭示的遺傳多態(tài)性能直接反映基因組DNA間的差異[1]。芒果（Mangifera indica L.）在中國(guó)已有1 300多年的栽培歷史[2]，經(jīng)過幾十年的種質(zhì)資源的收集和引種，中國(guó)的芒果種質(zhì)資源相對(duì)豐富，主要分布在海南、廣西、廣東、云南等地，并且芒果具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。亞洲東南部是芒果重要的起源地之一，據(jù)Kostermans等[3]報(bào)道，芒果屬有58個(gè)種和11個(gè)未確定種（中國(guó)的冬芒、桃葉芒和云南的野芒屬于不確定種），說明中國(guó)也是芒果的起源地之一。這些未確定種的野生芒果與普通芒果有著明顯的差異，其食用價(jià)值也遜于普通芒果，但一些特殊的性狀，可以作為種質(zhì)加以保存，待品種改良作為育種材料。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是一種基于PCR的新型標(biāo)記系統(tǒng)，顯性標(biāo)記， 由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li等于2001年提出[4]，也稱基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence Based Amplified Polymor-phism， SBAP）[5]。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。目前，在南瓜[6]、余甘子[7]、麗雜花苜蓿[8]等作物上有關(guān)SRAP標(biāo)記體系優(yōu)化及其在木瓜[9]、甜瓜[10]、山核桃[11]、楊樹[12]等作物的遺傳多樣性分析、菜薹雜交種指紋圖譜構(gòu)建[13]和甘薯[14]、茄子[15]遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到了應(yīng)用。

本研究運(yùn)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，該種設(shè)計(jì)具有均衡分散和整齊可比的特點(diǎn)，能達(dá)到事半功倍的效果，快速找到最佳組合。目前，有關(guān)SRAP在芒果上的研究還未見報(bào)道。本研究采用L16（45）正交設(shè)計(jì)對(duì)影響芒果SRAP反應(yīng)體系的模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、MgCl2等5個(gè)因素4個(gè)水平進(jìn)行篩選，以快速建立較為完整可靠的芒果最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系，為利用SRAP標(biāo)記分析芒果遺傳多樣性、分子標(biāo)記及輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芒果葉片取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)圃；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA（DL 2 000 Marker）購(gòu)自Takara公司；引物來自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

芒果總DNA提取參考Kit等研究的改良CTAB法[16]。

1.2.1 SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化 采用L16（45）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)模板DNA、引物、dNTPs、Taq聚合酶和MgCl2等5個(gè)影響因素設(shè)置4個(gè)水平16個(gè)組合。隨機(jī)選取引物組合ME2EM9引物對(duì)進(jìn)行正交試驗(yàn)（引物序列見表1），試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2和表3。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性45 s，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果基因組DNA的提取質(zhì)量

從芒果基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見其主帶清晰，沒有降解現(xiàn)象。使用分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280在1.8～2.0的范圍內(nèi)，DNA濃度在50～200 ng/μL之間，說明提取的芒果基因組DNA純度高，無(wú)蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)污染，滿足SRAP標(biāo)記對(duì)基因組DNA的純度要求。

2.2 SRAP-PCR正交直觀分析

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