• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息學(xué)分析

    2014-04-29 00:44:03蔣潔楊玉文王鐵霖楊?yuàn)檴?/span>趙廷昌
    中國(guó)瓜菜 2014年4期
    關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析

    蔣潔 楊玉文 王鐵霖 楊?yuàn)檴櫋≮w廷昌

    摘 要: 為了解西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Twin-arginine translocation system,Tat)關(guān)鍵基因tatB的生物信息學(xué)信息,利用相關(guān)軟件對(duì)西瓜嗜酸菌和其他7種革蘭氏陰性菌的TatB蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析,氨基酸序列分析以及遺傳距離分析;同時(shí)對(duì)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,西瓜嗜酸菌TatB的理化性質(zhì)和洋蔥布克氏菌(Burkholderia cenocepacia)更加接近,水稻白葉枯病菌TatB理化性質(zhì)與其他6種細(xì)菌的相差較遠(yuǎn);西瓜嗜酸菌TatB蛋白遺傳關(guān)系與水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)的最遠(yuǎn),與洋蔥酸皮病菌以及茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的較為接近;預(yù)測(cè)西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3個(gè)區(qū)域的疏水性比較高,在氨基酸序列的2~18位以及100~106位有2個(gè)跨膜區(qū)域,其三級(jí)結(jié)構(gòu)可能為“L”型。對(duì)西瓜嗜酸菌tatB基因進(jìn)行基本生物信息學(xué)分析,豐富了其生物信息學(xué)資料,有助于對(duì)西瓜嗜酸菌的致病機(jī)制進(jìn)行深入研究,為以后選育抗病品種以及研發(fā)特異性的新藥提供依據(jù)。

    關(guān)鍵詞: 西瓜嗜酸菌; tatB基因; 生物信息學(xué)分析

    Abstract: In order to learn basic knowledge of tatB gene in Acidovorax citrulli,the pathogen for bacterial fruit blotch(BFB),we used the method of bioinformatics to analyze TatB proteins in eight bacteria including A. citrulli. We analyzed physical hydrophobicity,transmembrane domain,tertiary structure in TatB protein of A. citrulli. The results showed that the physical and chemical properties of A. citrulli were more similar to that of Burkholderia cenocepacia. The TatB protein of A. citrulli was closer to that of B. cenocepacia and Ralstonia solanacearum in genetic distances. There were three parts in the TatB protein,a hydrophobic domain and two transmembrane domains. We predicated that the tertiary structure is L-shape. The bioinformatic data of TatB protein and tatB gene can help us to explore the pathogenic mechanism of BFB and to create new fungicides.

    Key words: Acidovorax citrulli; tatB gene; Bioinformatic analysis

    西瓜嗜酸菌[Acidovorax citrulli (Schaad et al.)]引起的西瓜細(xì)菌性果斑病是西甜瓜產(chǎn)業(yè)上的毀滅性病害,給我國(guó)的西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了極大的損失[1]。和其他的革蘭氏陰性菌一樣, A. citrulli的致病性與其蛋白分泌系統(tǒng)有緊密聯(lián)系[2]。許多研究都指出植物病原細(xì)菌的III型分泌系統(tǒng)與病原菌的致病力有重要聯(lián)系[3],但是對(duì)其他分泌系統(tǒng)與致病能力關(guān)系的報(bào)道比較少。雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Twin-arginine translocation,Tat)是革蘭氏陰性菌的兩步分泌系統(tǒng)的重要組成部分[4]。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜由細(xì)胞內(nèi)膜,周質(zhì)空間和細(xì)胞外膜組成[5]。Tat主要負(fù)責(zé)將折疊好的蛋白質(zhì)從細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間,它在II型和V型分泌系統(tǒng)中比較常見(jiàn)[6]。

    Tat系統(tǒng)主要由TatA、TatB、TatC和TatE組成,其中TatB和TatC處于核心地位[7]。有報(bào)道[8]指出,水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)中tatB和tatC基因的缺失會(huì)導(dǎo)致水稻白葉枯病菌的致病能力的降低。在梨火疫病菌(Erwinia amylovora)[9]和茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)[10]中Tat系統(tǒng)關(guān)鍵基因的缺失亦會(huì)導(dǎo)致病菌的致病力下降。

    在西瓜嗜酸菌中還沒(méi)有關(guān)于Tat系統(tǒng)的相關(guān)研究,本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法,對(duì)西瓜嗜酸菌的 tatB基因和TatB蛋白的理化性質(zhì)、疏水特性、跨膜區(qū)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究該基因的相關(guān)功能打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 相關(guān)細(xì)菌tatB基因的堿基序列和對(duì)應(yīng)蛋白的氨基酸序列均來(lái)自NCBI(National Center for Biotechnology Information,NCBI)。選擇水稻白葉枯病菌(X. oryzae)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、茄科雷爾氏菌(R. solanacearum)、洋蔥酸皮病菌(Burkholderia cenocepacia)、十字花科假單胞菌(P. brassicacearum)、大腸桿菌(Escherichia coli)和梨火疫病菌(E.amylovora)中的tatB基因進(jìn)行試驗(yàn),這些菌均為革蘭氏陰性,其中大腸桿菌的Tat系統(tǒng)研究比較深入,其余6種細(xì)菌與西瓜嗜酸菌一樣均為植物病原細(xì)菌。

    1.1.2 相關(guān)軟件和在線工具 ProtParam(http;//web. Expasy.org/protpatam/),MEGA 4.0.2,Hmoment,Tmap, TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html),CDD search,Swiss-Model(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html),Protein Data Bank,PyMol.

    1.2 方法

    1.2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

    在NCBI上面登錄西瓜嗜酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AAC00-1的全基因組序列查找到tatB基因,通過(guò)閱讀基因注釋了解該基因的基本功能;在Uniprot中找到AAC00-1的TatB蛋白了解該蛋白的基本信息。

    1.2.2 分析8種細(xì)菌TatB蛋白理化性質(zhì) 在NCBI上面下載8種細(xì)菌的TatB蛋白氨基酸序列,利用在線工具ProtParam(http://web. Expasy.org/protpatam/)分析其理化性質(zhì)的差異。

    1.2.3 構(gòu)建8種細(xì)菌TatB蛋白質(zhì)的遺傳進(jìn)化樹(shù)

    在MEGA 5上對(duì)幾種TatB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析進(jìn)化距離采取NJ鄰位法,自展檢驗(yàn),重復(fù)1 000次。

    1.2.4 預(yù)測(cè)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性 用EMBOSS軟件包里的Hmoment軟件進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè),為進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。

    1.2.5 預(yù)測(cè)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu) 用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_

    form.html)在線工具和EMBOSS軟件包里面的Tmap軟件對(duì)西瓜嗜酸菌(A. citrulli)的TatB蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),為預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)做好準(zhǔn)備。

    1.2.6 模擬西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu) 在NCBI上BLAST目的蛋白的氨基酸序列,了解該蛋白從屬于哪個(gè)蛋白家族以及該蛋白家族的核心序列信息。運(yùn)用NCBI上的在線工具CDD Search 找到該蛋白家族的主要分布情況,以及它們的保守核心序列的三維結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)Swiss-Model(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)往PDB(Protein Date Bank)中輸入目的蛋白序列,最后利用PyMol軟件顯示預(yù)測(cè)出的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

    tatB基因?yàn)槲鞴鲜人峋蚪M上的1 156 059至1 156 553位堿基,基因序號(hào)(Gene ID,GI)為

    120 608 714,染色提上的編號(hào)為1 054。其CDS區(qū)域由495 bp堿基組成。翻譯出來(lái)的TatB蛋白質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)膜具有164個(gè)氨基酸殘基,是雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組分,和TatA以及TatC一起負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)折疊好的、信號(hào)肽上具有雙精氨酸基序的底物蛋白質(zhì)(表1)。

    表1 Uniprot中西瓜嗜酸菌TatB蛋白總體注釋

    2.2 8種細(xì)菌TatB蛋白的理化性質(zhì)

    用ProtParam分析8種細(xì)菌的TatB蛋白的理化性質(zhì)(表2),發(fā)現(xiàn)除了水稻白葉枯病菌的TatB蛋白的氨基酸殘基組成超過(guò)了200個(gè)之外,其他7種細(xì)菌的TatB的氨基酸殘基數(shù)都在140~190之間。西瓜嗜酸菌、茄科雷爾氏菌及洋蔥酸皮病菌的理論等電點(diǎn)偏堿性且差距不大,其他細(xì)菌TatB的偏向酸性且差距較大。8種細(xì)菌的TatB蛋白質(zhì)里面丙氨酸所占比重最大,其次所占比重較大的是亮氨酸和精氨酸。等電點(diǎn)偏堿性的TatB蛋白中其堿性氨基酸的比例較酸性氨基酸的大,等電點(diǎn)偏酸性的則相反。8種細(xì)菌的TatB蛋白中只有西瓜嗜酸菌和水稻白葉枯病菌的TatB蛋白穩(wěn)定。除了水稻白葉枯病菌的TatB蛋白主要表現(xiàn)為疏水性外,其他細(xì)菌的TatB蛋白均為兩性。

    2.3 構(gòu)建8種細(xì)菌TatB蛋白質(zhì)的遺傳進(jìn)化樹(shù)

    比對(duì)8種細(xì)菌TatB蛋白的氨基酸序列后用MEGA5建立遺傳進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明西瓜嗜酸菌的TatB蛋白與茄科雷爾氏菌和洋蔥酸皮病菌的為一類,它們的遺傳距離比較近,而兩種假單胞屬的細(xì)菌的TatB蛋白質(zhì)在同一個(gè)分枝說(shuō)明它們TatB蛋白的親緣關(guān)系更加接近。而水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他幾種細(xì)菌的遺傳距離最遠(yuǎn),這可能與其蛋白質(zhì)的大小也有關(guān)系,從2.2中的理化性質(zhì)分析中可知水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他細(xì)菌的相差很大。

    2.4 預(yù)測(cè)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性

    用EMBOSS軟件包里的Hmoment軟件對(duì)西瓜嗜酸菌的TatB蛋白進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。軟件預(yù)測(cè),結(jié)果表明在西瓜嗜酸菌的3個(gè)部位的疏水性較強(qiáng):1~10氨基酸殘基處,90~105氨基酸殘基處以及135氨基酸殘基附近。預(yù)測(cè)目的蛋白可能存在2~3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。

    2.5 預(yù)測(cè)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)

    使用在線工具TMpred和EMBOSS軟件包里面的Tmap軟件對(duì)西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)目的蛋白在2~18位和100~106位氨基酸殘基之間有兩個(gè)明顯的跨膜區(qū)域(圖3和圖4)。該結(jié)果與2.4中疏水性預(yù)測(cè)的結(jié)果相符。

    2.6 模擬西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

    通過(guò)模擬目的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,可以更形象地將它的功能和結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)。在NCBI上BLAST目的蛋白序列,發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于mttA/Hcf106 超蛋白家族。該家族的核心區(qū)域三級(jí)結(jié)構(gòu)是“L”型(圖5),主要分布在雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)中和真核生物的轉(zhuǎn)移起始因子中。

    用SWISS-MODEL在線工具模擬、PyMol軟件得到的目的蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有3個(gè)α螺旋,其主要的三維結(jié)構(gòu)模型有2個(gè)(圖6-A、B),但是考慮到其超家族的核心區(qū)域三級(jí)結(jié)構(gòu)、TatB蛋白的跨膜分布,以及預(yù)測(cè)出來(lái)的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,認(rèn)為圖6(B)中的模型更正確。

    3 討 論

    TatB蛋白是雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分。同很多的植物病原細(xì)菌一樣,西瓜嗜酸菌也具有雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),該菌中Tat的主要組成部分和大腸桿菌一樣包括TatA,TatB和TatC三部分。

    本研究主要對(duì)西瓜嗜酸菌TatB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜嗜酸菌中tatB基因位于基因組的1 156 059至1 156 553位堿基上,由495 bp核苷酸組成,翻譯產(chǎn)物具有164個(gè)氨基酸殘基。TatB分布在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜,起移位酶的作用。它的理化性質(zhì)和洋蔥酸皮病菌以及茄科雷爾氏菌比較相似,而細(xì)菌的分類學(xué)上這3種細(xì)菌都曾被劃分到假單胞菌屬中,因此從某種程度上來(lái)說(shuō)它們的TatB蛋白的遺傳關(guān)系可能比較接近。但是根據(jù)圖1的進(jìn)化樹(shù)分布,發(fā)現(xiàn)2種假單胞菌屬的細(xì)菌跟它們之間相差得還比較遠(yuǎn),這說(shuō)明由一個(gè)蛋白或一個(gè)基因來(lái)確定進(jìn)化2個(gè)物種的進(jìn)化關(guān)系是不準(zhǔn)確的。水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他細(xì)菌的TatB蛋白相差比較大,所以導(dǎo)致其理化性質(zhì)差異顯著、親緣關(guān)系比較疏遠(yuǎn)。

    西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)比較一致,試驗(yàn)的結(jié)構(gòu)顯示它具有2~3個(gè)疏水性較高的部位,2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。其三級(jí)結(jié)構(gòu)與它從屬的超家族mttA/Hcf106核心序列區(qū)域一致,都是“L”型。

    目前對(duì)大腸桿菌的Tat系統(tǒng)的研究比較深入,但是具體的機(jī)制還是不夠明確。而很多研究報(bào)道指出Tat蛋白分泌系統(tǒng)關(guān)鍵基因的缺失會(huì)降低植物病原細(xì)菌的毒力。在已有的報(bào)道中,并沒(méi)有關(guān)于人和動(dòng)物的Tat系統(tǒng)[11]。所以對(duì)研究西瓜嗜酸菌TatB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,能夠充實(shí)其分子生物學(xué)資料,對(duì)于揭示西瓜嗜酸菌的致病機(jī)制、發(fā)明新型靶標(biāo)農(nóng)藥及培育抗性品種有重要意義。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 牛慶偉,蔣 薇,孔秋生,等. HACCP體系在西瓜嫁接苗BFB綜合防控中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)瓜菜,2014,27(1): 1-4.

    [2] Casson C N,Copenhaver A M,Zwack E E,et al. Caspase-11 activation in response to bacterial secretion systems that access the host cytosol[J]. PLOS Pathogens,2013,9(6): e1003400.

    [3] Alfano J R,Collmer A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense[J]. Annu Rev Phytopathol,2004,42: 385-414.

    [4] Sandkvist M. Biology of type II secretion[J]. Molecular microbiology,2001,40(2): 271-283.

    [5] Pukatzki S,Ma A T,Sturtevant D,et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(5): 1528-1533.

    [6] Bogsch E G,Sargent F,Stanley N R,et al. An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria[J]. Journal of Biological Chemistry,1998,273(29): 18003-18006.

    [7] de Buck E,Lebeau I,Maes L,et al. A putative twin-arginine translocation pathway in Legionella pneumophila[J]. Biochem Biophys Res Cmun,2004,317: 654-661.

    [8] Chen L,Hu B S,Qian G L,et al.Identification and molecular characterization of twin- arginine translocation system(Tat) in Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain PXO99[J]. Archives of Microbio-logy,2009,191:163-170.

    [9] 于洋洋,劉倩倩,徐恩麗,等. 梨火疫病菌(Erwinia amylovora)雙精氨酸運(yùn)輸系統(tǒng)基因(tatC)的功能分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2011,19(6):1081-1088.

    [10] González E T,Brown D G,Swanson J K,et al.Using the Ralstonia solanacearum Tat secretome to identify bacterial wilt virulence factors[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(12):3779-3786.

    [11] 張 靜,張 明. 大腸桿菌Tat轉(zhuǎn)運(yùn)酶的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志,2006,23(6):1-3.

    猜你喜歡
    生物信息學(xué)分析
    雷公藤牻牛兒基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆與表達(dá)分析
    斑節(jié)對(duì)蝦金屬硫蛋白全基因DNA克隆及生物學(xué)信息分析
    雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆與表達(dá)分析
    滇龍膽乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)分析
    西瓜食酸菌CusB蛋白的生物信息學(xué)分析
    羊種布氏桿菌3型Omp25基因序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析
    禾谷鐮刀菌甾醇14α脫甲基酶基因cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
    湖羊SPLUNC1基因序列的生物信息學(xué)分析
    西藏牦牛NGB基因克隆及生物信息學(xué)分析
    地黃纖維素合酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    伊人久久国产一区二区| 国产精品.久久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美 日韩 精品 国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费观看的影片在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产人妻一区二区三区在| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区有黄有色的免费视频| av在线亚洲专区| 国产高清不卡午夜福利| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产亚洲91精品色在线| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲国产色片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂网av新在线| 成人欧美大片| 欧美最新免费一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 欧美bdsm另类| 久久久久久久久大av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 嫩草影院入口| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一级毛片 在线播放| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 成人综合一区亚洲| 国产视频内射| 国精品久久久久久国模美| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 2022亚洲国产成人精品| 国产综合懂色| 成人欧美大片| 在线播放无遮挡| 国产一区有黄有色的免费视频| 婷婷色av中文字幕| 香蕉精品网在线| 一级av片app| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜激情福利司机影院| 久久久色成人| 69av精品久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品久久国产蜜桃| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲综合精品二区| 一级二级三级毛片免费看| 嫩草影院入口| 美女内射精品一级片tv| 亚洲美女视频黄频| 国产一区二区三区av在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 精品酒店卫生间| 亚洲精品一二三| h日本视频在线播放| 99久久九九国产精品国产免费| 九草在线视频观看| 欧美+日韩+精品| 成年版毛片免费区| 亚洲三级黄色毛片| 国产色婷婷99| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 超碰97精品在线观看| 极品教师在线视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜福利高清视频| 亚洲色图av天堂| 黄色一级大片看看| 99视频精品全部免费 在线| av天堂中文字幕网| 内射极品少妇av片p| av在线亚洲专区| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美成人午夜免费资源| 国内精品宾馆在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产毛片在线视频| 三级国产精品片| 亚洲图色成人| 国产 一区 欧美 日韩| 少妇熟女欧美另类| av在线老鸭窝| 欧美97在线视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费黄频网站在线观看国产| kizo精华| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成年女人在线观看亚洲视频 | 在线看a的网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产熟女欧美一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久亚洲国产成人精品v| 在线a可以看的网站| 日本免费在线观看一区| 大话2 男鬼变身卡| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲人成网站在线观看播放| 麻豆成人av视频| 丝袜喷水一区| 高清欧美精品videossex| 一级片'在线观看视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av日韩在线播放| 五月玫瑰六月丁香| av国产久精品久网站免费入址| 国产69精品久久久久777片| 日本一本二区三区精品| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 国产极品天堂在线| 成人国产av品久久久| 久久久久久久久久久丰满| 欧美变态另类bdsm刘玥| 九九在线视频观看精品| 亚洲自拍偷在线| 欧美另类一区| 中文字幕亚洲精品专区| av在线蜜桃| 成人特级av手机在线观看| 超碰97精品在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 91久久精品国产一区二区三区| 干丝袜人妻中文字幕| 大香蕉久久网| 欧美国产精品一级二级三级 | 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 色吧在线观看| 国产精品一二三区在线看| 免费看光身美女| 少妇人妻久久综合中文| 少妇 在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本欧美国产在线视频| 搞女人的毛片| 亚洲av免费在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 中文资源天堂在线| 国产精品av视频在线免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 免费人成在线观看视频色| 中文欧美无线码| 色播亚洲综合网| 久久久久久久国产电影| 国产精品久久久久久久电影| 久久久国产一区二区| 一级毛片我不卡| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品蜜桃在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丝袜美腿在线中文| 久热久热在线精品观看| 男人添女人高潮全过程视频| 22中文网久久字幕| 免费大片18禁| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美三级亚洲精品| 成人特级av手机在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 免费大片黄手机在线观看| 国产 一区精品| 亚洲精品国产av成人精品| 在线观看人妻少妇| 国产有黄有色有爽视频| 色视频在线一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 秋霞伦理黄片| 久久99精品国语久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 最新中文字幕久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久热这里只有精品99| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 新久久久久国产一级毛片| 国产永久视频网站| 各种免费的搞黄视频| 人妻系列 视频| 亚洲色图av天堂| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜精品一区二区三区免费看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 99久久中文字幕三级久久日本| 高清欧美精品videossex| 观看免费一级毛片| 深夜a级毛片| 黄色怎么调成土黄色| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品国产露脸久久av麻豆| 各种免费的搞黄视频| 久久精品久久久久久久性| 亚洲无线观看免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 青春草国产在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产黄频视频在线观看| 简卡轻食公司| 欧美激情国产日韩精品一区| 看十八女毛片水多多多| 国产高清国产精品国产三级 | 美女被艹到高潮喷水动态| 我的老师免费观看完整版| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲不卡免费看| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧洲日产国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 色综合色国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一级a做视频免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 大香蕉久久网| 黑人高潮一二区| 干丝袜人妻中文字幕| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇人妻久久综合中文| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲国产av新网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费av观看视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久女婷五月综合色啪小说 | 水蜜桃什么品种好| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成人福利小说| 超碰97精品在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一级毛片电影观看| 如何舔出高潮| 亚洲精品,欧美精品| av在线播放精品| 久久久精品免费免费高清| 日韩人妻高清精品专区| 99久国产av精品国产电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产男女内射视频| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲熟女精品中文字幕| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 日日啪夜夜撸| 下体分泌物呈黄色| 不卡视频在线观看欧美| 久久影院123| 18禁动态无遮挡网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 成人国产麻豆网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品乱久久久久久| 老女人水多毛片| 男女边摸边吃奶| 性色avwww在线观看| 午夜视频国产福利| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 简卡轻食公司| av.在线天堂| 久久久精品94久久精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 免费看a级黄色片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产在视频线精品| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片 在线播放| 亚洲国产精品成人久久小说| 伦理电影大哥的女人| 深爱激情五月婷婷| 在线观看一区二区三区激情| 欧美日韩在线观看h| 黄色视频在线播放观看不卡| 内射极品少妇av片p| 色吧在线观看| 久热久热在线精品观看| 日韩欧美精品v在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 中文字幕亚洲精品专区| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 欧美高清成人免费视频www| 99热国产这里只有精品6| 国产精品一二三区在线看| 日韩国内少妇激情av| 少妇人妻久久综合中文| 人妻少妇偷人精品九色| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久精品欧美日韩精品| 嘟嘟电影网在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日本三级黄在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| av福利片在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丝袜喷水一区| 在线观看一区二区三区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美成人午夜免费资源| freevideosex欧美| 婷婷色综合www| 国产av码专区亚洲av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费人成在线观看视频色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 香蕉精品网在线| 国内精品美女久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜视频国产福利| 久久ye,这里只有精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久成人免费电影| 热re99久久精品国产66热6| 国产黄色免费在线视频| 91久久精品国产一区二区成人| 青春草视频在线免费观看| 午夜日本视频在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久精品人妻少妇| videossex国产| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av免费观看日本| 男人爽女人下面视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲,一卡二卡三卡| 男人添女人高潮全过程视频| 视频区图区小说| 午夜精品国产一区二区电影 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久久网色| av在线蜜桃| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| av一本久久久久| 少妇的逼水好多| 成人特级av手机在线观看| 看黄色毛片网站| 777米奇影视久久| 极品教师在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 青青草视频在线视频观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜脚勾引网站| 精品熟女少妇av免费看| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲性久久影院| 日本av手机在线免费观看| 国产成人a区在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人免费无遮挡视频| 熟女av电影| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久网色| 亚洲av中文av极速乱| 欧美成人一区二区免费高清观看| av.在线天堂| 丝袜美腿在线中文| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费观看性生交大片5| 国产毛片a区久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲人成网站在线播| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 精品久久久久久电影网| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲自拍偷在线| 99热6这里只有精品| 黄色日韩在线| 99久久精品国产国产毛片| 黄色一级大片看看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产在线一区二区三区精| 成年女人看的毛片在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 成人免费观看视频高清| av国产免费在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产乱来视频区| 99视频精品全部免费 在线| av免费观看日本| 日韩成人av中文字幕在线观看| 少妇熟女欧美另类| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 九色成人免费人妻av| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 少妇丰满av| 免费观看的影片在线观看| 人人妻人人看人人澡| 各种免费的搞黄视频| 日韩一区二区三区影片| 22中文网久久字幕| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产高清三级在线| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久精品性色| 91久久精品电影网| 在线免费十八禁| 2021天堂中文幕一二区在线观| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品久久久精品久久久| 搞女人的毛片| 午夜老司机福利剧场| 国产精品99久久久久久久久| 丰满乱子伦码专区| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲国产av新网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费大片18禁| 精品少妇黑人巨大在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 中文字幕av成人在线电影| 欧美另类一区| av专区在线播放| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | www.av在线官网国产| 一级片'在线观看视频| av在线亚洲专区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人妻 亚洲 视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 麻豆成人av视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久国产网址| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人freesex在线| 中国国产av一级| 国产伦精品一区二区三区四那| 七月丁香在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 一级片'在线观看视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产伦精品一区二区三区四那| xxx大片免费视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产欧美日韩精品一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲性久久影院| 亚洲精品国产成人久久av| 成人午夜精彩视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男女边摸边吃奶| 国产精品99久久99久久久不卡 | av福利片在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 看免费成人av毛片| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久人人爽人人片av| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久国产精品人妻一区二区| eeuss影院久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 婷婷色综合大香蕉| 国产免费又黄又爽又色| 欧美精品国产亚洲| 日韩国内少妇激情av| 国精品久久久久久国模美| 最近中文字幕2019免费版| 一级毛片我不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 少妇熟女欧美另类| 七月丁香在线播放| 国产成人a区在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久噜噜| 亚洲精品色激情综合| 欧美激情国产日韩精品一区| 婷婷色综合www| 两个人的视频大全免费| 晚上一个人看的免费电影| 国产一区二区在线观看日韩| 成人欧美大片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 简卡轻食公司| 久久久久精品久久久久真实原创| 成人一区二区视频在线观看| 激情 狠狠 欧美| 大陆偷拍与自拍| videossex国产| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 又爽又黄无遮挡网站| 五月玫瑰六月丁香| 国产免费又黄又爽又色| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲欧美日韩东京热| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av中文av极速乱| 韩国av在线不卡| 久久久久久伊人网av| 中文字幕久久专区| 丰满乱子伦码专区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | eeuss影院久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产高清有码在线观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久久亚洲中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利在线在线| 免费观看的影片在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 夫妻午夜视频| 人妻一区二区av| 久久精品久久精品一区二区三区| 免费看不卡的av| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品一区在线观看国产| 97热精品久久久久久| 日韩成人伦理影院| 在线观看美女被高潮喷水网站| 老女人水多毛片| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 黑人高潮一二区| 国产精品国产av在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩一区二区视频免费看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品国产成人久久av| 99热这里只有是精品50| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇熟女欧美另类| 国产永久视频网站| 久热久热在线精品观看| 国产熟女欧美一区二区| 69人妻影院| 国产精品不卡视频一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 最近中文字幕2019免费版| 国产 精品1| 中文欧美无线码| 高清毛片免费看| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久a久久爽久久v久久| 久久久久久国产a免费观看| 精品一区二区三卡| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产日韩一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 白带黄色成豆腐渣| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 最新中文字幕久久久久| 一级av片app| 国产精品成人在线| 99热6这里只有精品| 中文天堂在线官网| 青春草国产在线视频|