薄皮甜瓜采后病害生防菌株的篩選及鑒定

曹旭　陳靜宇　張淑梅等

摘要[目的]從薄皮甜瓜體表分離篩選對引起薄皮甜瓜采后病害主要病原真菌具有拮抗作用的生防菌株，并對其進行鑒定確定分類地位，為薄皮甜瓜采后病害的防治提供高效菌株。[方法]采用活體生測的方法從甜瓜瓜表篩選生防菌株，利用非寄養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）API 20 NE自動鑒定系統(tǒng)測定菌株C3的生理生化指標(biāo)。[結(jié)果]從甜瓜表面分離篩選出2株對粉紅單端孢（Trichothecium roseum）防治效果達(dá)80%以上的生防菌株C3、B3；通過平板對峙試驗表明，菌株C3對引起采后病害的2種病原菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）和鐮刀菌（Fusarium spp. ）的抑菌能力均優(yōu)于B3； 菌株C3對粉紅單端孢（Trichothecium roseum） 的抑菌效果較好，達(dá)到67.7%；對鐮刀菌（Fusarium spp. ）的抑菌率次之，為27.9%；應(yīng)用API 20 NE系統(tǒng)分析， 通過形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色將菌株C3初步鑒定為淺黃假單胞菌Pseudomonas luteola。[結(jié)論]從甜瓜表面分離篩選獲得1株生防菌株C3，該菌株對引起薄皮甜瓜采摘后病害的主要病原菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）具有較強的拮抗作用，并初步鑒定為淺黃假單胞菌（Pseudomonas luteola）。

關(guān)鍵詞甜瓜；采后病害；生防菌；篩選

中圖分類號S436.42文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03552-03

作者簡介曹旭（1988-），女，黑龍江哈爾濱人，研究實習(xí)員，在讀碩士，從事農(nóng)業(yè)微生物、生物防治研究方面。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)業(yè)微生物、生物防治研究。

薄皮甜瓜（Cucumis melo var. makuwa Makino），因其果實甘甜，清爽芳香，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，而倍受人們青睞。統(tǒng)計顯示，我國新疆、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古等地區(qū)都有大量的甜瓜種植，栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]?！笆濉逼陂g我國甜瓜種植面積約533萬hm2，但隨著甜瓜的大面積集中種植，成熟期也相對集中，再加上其不耐儲運的特點，采后病害發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重。從而使甜瓜不能遠(yuǎn)距離外銷，即使外銷，也多是未成熟瓜，失去了應(yīng)有的風(fēng)味，大大降低了其食用價值和經(jīng)濟價值。因而采后病害成為目前制約甜瓜經(jīng)濟效益的主要障礙。據(jù)估計，采后病害造成的損失高達(dá)35%～50%[2-5]。研究表明，造成甜瓜采后腐爛變質(zhì)的主要原因是由于多種病原菌的侵染[6-7]，其中粉紅單端孢（Trichothecium roseum）和鐮刀菌（Fusarium spp.）分別引起的粉霉病和白霉病是甜瓜采后發(fā)生的主要病害[8]。

目前，在甜瓜采后病害的眾多防治方法中，化學(xué)藥劑使用最廣泛，雖然防治效果顯著，但存在抗藥性和殘留問題[9]。且農(nóng)藥殘留對人體健康和環(huán)境的潛在危害，已成為全社會關(guān)心的問題。自20世紀(jì)80年代以來，生物防治作為一種控制果蔬采后病害的新途徑逐漸被人們接受、重視，并成為研究的熱點。由于生物防腐不具有化學(xué)防腐保鮮帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及連續(xù)使用產(chǎn)生抗藥性等缺點而將逐步取代化學(xué)殺菌劑，成為一種新的保鮮方法[10-13]。生物防治應(yīng)用于采后病害的防治，已取得了令人鼓舞的成績?，F(xiàn)已證明拮抗細(xì)菌Pseudomonas sp.和Bacillus sp.對柑橘采后病害有很好的防治效果。美國等已有利用拮抗菌防治核果類、仁果類、柑橘及一些蔬菜采后病害的成功先例。而我國在采后病害的生物防治方面研究較少，尤其是利用生防菌防治甜瓜采后病害方面的研究更少，為此，筆者通過從甜瓜表面分離篩選出生防菌株，并利用非寄養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）API 20 NE自動鑒定系統(tǒng)對分離篩選出的菌株進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1材料樣品：哈爾濱市果蔬批發(fā)市場購買的大小均一、成熟度一致、無病無傷的薄皮甜瓜若干。

菌株：粉紅單端孢菌（Trichothecium roseum）、鐮刀菌（Fusarium spp.）均購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

試劑：EDTA、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、去離子水等試劑均為分析純；非寄養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）API 20 NE購自法國梅里埃公司。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 ml）；NYD培養(yǎng)基（牛肉浸膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 ml）。

1.2生防菌的分離

1.2.1生防菌的初步篩選。用2 L 0.2 mol/L磷酸緩沖液分批次洗滌30個健康甜瓜的表面，將洗滌液透析濃縮至100 ml保存待用。 以粉紅單端孢為靶標(biāo)病原菌，接種在PDA培養(yǎng)基于28 ℃溫箱中進行培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長滿培養(yǎng)皿且有大量孢子產(chǎn)生時，用無菌水洗脫，配成濃度1×105個/ml的孢子懸浮液。將薄皮甜瓜表面進行消毒，用無菌水清洗后晾干，在瓜表面用手術(shù)刀劃出8個3.0 cm×0.5 cm大小的傷口，每瓜上均設(shè)1個健康對照（只接無菌水），1個感病對照（只接種粉紅單端孢孢子懸浮液），6個洗滌液處理（先接100 μl濃縮液，待風(fēng)干后接種20 μl粉紅單端孢孢子懸浮液），靜置30 min，裝于PVC袋中室溫保存，4 d后觀察甜瓜發(fā)病情況。

選取未發(fā)病或發(fā)病較輕的處理，將該批次的濃縮液進行梯度稀釋涂布于NYDA培養(yǎng)基上，置于32 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，挑選不同菌落形態(tài)的菌株進行標(biāo)號并分離培養(yǎng)；分離出的單個菌落接入裝有NYD培養(yǎng)基（5 ml）的試管中，于32 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，以粉紅單端孢為靶標(biāo)病原菌進行生測待用。

1.2.2生防菌的復(fù)篩。將初篩所得菌株以粉紅單端孢為靶標(biāo)病原菌，參照“1.2.1”方法在瓜上進行復(fù)篩，每個處理重復(fù)4次，每個甜瓜均設(shè)1個病原對照、1個空白對照、6個不同待測菌株，觀察甜瓜發(fā)病情況，測量病斑直徑，計算防治效果。篩選具有較好生防效果（防治效果大于80%）的生防菌，進行純化并保藏。

防治效果（%）=（對照病斑平均直徑-處理病斑平均直徑）/對照病斑平均直徑×100。

1.3生防菌的拮抗作用測定分別以粉紅單端孢和鐮刀菌為靶標(biāo)對象，檢測具有生防效果的生防菌株的拮抗能力。在PDA平板培養(yǎng)基上劃十字線分出4個區(qū)域，每個區(qū)域中心分別接入直徑8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅，同時在平板十字線上劃入待測生防菌液，設(shè)無生防菌液為對照，重復(fù)3次。于25 ℃培養(yǎng)，當(dāng)對照真菌長至十字線位置時觀察處理組抑菌效果，測量抑菌帶寬。

抑菌率（%）=（對照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對照菌絲直徑×100。

1.4生防細(xì)菌的理化鑒定觀察所篩目標(biāo)生防菌株在NYDA平板培養(yǎng)基上的單菌落特征，以及在顯微鏡下的菌體形態(tài)[7]。參照《微生物學(xué)實驗技術(shù)》[14]，對目標(biāo)菌株分別進行革蘭氏染色、氧化酶試驗、接觸酶試驗。將生防菌株C3的單菌落接種于NYD 平板培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)18 h，利用非寄養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）API 20 NE自動系統(tǒng)鑒定系統(tǒng)，按說明方法進行鑒定，并按文獻[14]所述測定生理生化方法進行補充鑒定，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1生防菌的分離篩選由表1可知，從甜瓜表面附著的微生物中初步分離出44株菌株，將這些菌株在甜瓜上進行重復(fù)篩選，篩選得到24株對粉紅單端孢具有防治效果的菌株，其中2株生防菌株具有較好的防治效果，防治效果大于80%。

2.2菌株C3、B3對粉紅單端孢、鐮刀菌的抑菌效果通過平板對峙法，在PDA培養(yǎng)基上測定生防菌株C3、B3對粉紅單端孢和鐮刀菌均有一定的抑菌效果，其中菌株C3對2種靶標(biāo)病原菌抑菌能力均優(yōu)于菌株B3；菌株C3對粉紅單端孢的抑菌效果較好，抑菌率可達(dá)67.7%；對鐮刀菌的抑菌率次之，為27.9%（圖1）。

注：a.鐮刀菌對照；b.C3對鐮刀菌的抑菌效果；c.粉紅單端孢對照；d.C3對粉紅單端孢的抑菌效果。

2.3菌株C3 的生理生化特征介于菌株C3革蘭氏染色、氧化酶試驗、接觸酶試驗均為陰性，符合非寄養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）API 20 NE的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，因此利用API 20NE試劑盒鑒定菌株 C3的生理生化反應(yīng)。

從表2可以看出，培養(yǎng)物革蘭氏染色試驗呈陰性，接觸還原硝酸鹽、葡萄糖產(chǎn)酸、精氨酸水解酶、β葡萄糖甙酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽、蘋果酸、檸檬酸、苯乙酸呈陽性，接觸吲哚產(chǎn)生、尿素酶、明膠液化、癸酸、已二酸、氧化酶、接觸酶呈陰性。

根據(jù)菌株C3的 API 20NE系統(tǒng)的判讀結(jié)果進行比對，C3與Pseudomonas的生理生化指標(biāo)較相近，菌株C3可初步鑒定為淺黃假單孢菌Pseudomonas luteola，鑒定結(jié)果可信度為96.8%。

3結(jié)論與討論

生防菌株C3是以甜瓜采后病原菌粉紅單端孢為靶標(biāo)菌，以室內(nèi)生測的方法分離得到。經(jīng)過初篩、復(fù)篩及反復(fù)的對峙試驗表明，菌株C3的防治效果較好，可達(dá)88.5%，且對引起甜瓜主要采后病害的病原菌粉紅單端孢和鐮刀菌具有較好的抑菌效果，分別可達(dá)67.7%和27.9%。這表明菌株C3在防治效果及抑菌能力方面都是一株具有潛力的生防菌。

通過形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、結(jié)合API 20NE系統(tǒng)細(xì)菌生理生化特性測定，初步確定了其分類地位，將生防細(xì)菌C3鑒定為淺黃假單孢菌Pseudomonas luteola。在選擇鑒定方法時，參考一些微生物鑒定試劑盒，但發(fā)現(xiàn)依據(jù)API 20NE系統(tǒng)可以將菌株鑒定到屬，但由于假單胞菌屬下種間遺傳距離非常近，此方法不足以將菌株的分類地位確定到種的水平，為了使鑒定結(jié)果更加可信，需與分子生物學(xué)手段相結(jié)合協(xié)同16S rDNA序列分析才能較為準(zhǔn)確地鑒定出分類地位。

近年來，諸多研究者從果蔬表面分離自然生長的微生物[15]，該研究也采用這種方式從健康的甜瓜表面分離得到生防菌C3，該菌株來源于甜瓜表面，且對引起甜瓜主要采后病害的病原菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）和鐮刀菌（Fusarium spp.）具有較好的抑菌能力和較高的防治效果。該研究只對所篩選菌株C3做了初步鑒定，而在定殖能力、生防能力及安全性的評價等方面仍需要做更深入的探索。

參考文獻

[1] 陳雷，秦智偉.甜瓜采后生理和貯藏保鮮研究進展[J].北方園藝，1999（6）：24-27.

[2] 劉君璞，許勇，孫小武，等.我國西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)“十一五”的展望及建議[J].中國瓜菜，2006（1）：1-3.

[3] 馬躍.中國西甜瓜業(yè)21世紀(jì)進入WTO后的發(fā)展分析[J].中國西瓜甜瓜，2000（4）：38-40.

[4] 胡俊，劉雙平，黃俊霞，等.越冬病殘體中哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌存活力的研究[C]//中國植物病理學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會論文集.北京： 中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2006：125.

[5] 陳年來，安力.甘肅厚皮甜瓜穩(wěn)定發(fā)展之策略[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，33（4）：12-13.

[6] 唐文華，陳策，王偉，等.厚皮甜瓜采后病害的發(fā)生及生物防治[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1998（10）：65-67.

[7] WANG W，TANG W H ，HANG Y，et al.Investigation and biological contro1 of postharvest diseases of muskmelon[A].Quality assurance in agriculture produce[M].Camberra： ACIAR Proceedings，2000.

[8] 葛永紅.“銀帝” 甜瓜主要采后病害的潛伏侵染及抗病性誘導(dǎo)[D].蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[9] HUANG Y，DEVERALL B J，TANG W H，et al.Foliar application of acibenzolarSmethyl and protection of postharvest rock melons and Hami melons from disease[J].European Journal of Plant Pathology，2000，106（7）：651-656.

[10] WISNIEWSKI M E，WILSON C L.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables recent advance[J].Hort Science，1992，27：94-98.

[11] SPADARO D，GULLINO M L.State of the art and future prospects of the biological control of postharvest fruit diseases[J].International Journal of Food Microbiology，2004，91：185-194.

[12] 童蘊慧，徐敬友，陳夕軍.番茄灰霉病菌拮抗菌的篩選和應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)研究，2001，24（4）：25-28.

[13] 郭達(dá)偉.果蔬保鮮劑的應(yīng)用研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2001，17（3）：62-63.

[14] 胡俊.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古文化出版社，2001.