粘紅酵母和地衣芽孢桿菌菌肥對蕓豆豆苗生長的影響

薛飛燕　趙爽　玉晏飛　馬蘭青　趙曉萌

摘要[目的] 為了探索餐廚廢水資源化利用，以生產(chǎn)生物肥料的可行性。[方法]以餐廚廢水為原料， 分別接種粘紅酵母（R. glutinis）和地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得生物菌肥，以基肥形式進行蕓豆盆栽肥效測試， 分別測定了粘紅酵母菌肥、地衣芽孢桿菌菌肥及二者的混合菌肥對蕓豆豆苗生長的影響。[結(jié)果]粘紅酵母利用餐廚廢水發(fā)酵24 h以后可積累生物量10 g/L以上，地衣芽孢桿菌利用餐廚廢水發(fā)酵60 h后高溫淀粉酶活力可達950 U以上；施以單一菌肥時，粘紅酵母菌肥和地衣芽孢桿菌菌肥對豆苗徑粗增長均有促進作用（前者的促進作用更明顯），而對豆苗株高增長有明顯的抑制效應；以不同劑量、不同比例施以混合菌肥時，當粘紅酵母與地衣芽孢桿菌質(zhì)量比為4∶1， 總施肥量為0.2 g/盆時，混合菌肥對徑粗的促進作用最大，對株高的抑制效應最小。[結(jié)論] 粘紅酵母和地衣芽孢桿菌的混合菌對蕓豆豆苗徑粗增長有明顯的促進作用，可作為生物肥料使用。

關鍵詞粘紅酵母；地衣芽孢桿菌；菌肥；蕓豆

中圖分類號S144文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03541-03

基金項目北京市教委面上基金項目（KM201210020009）；北京市優(yōu)秀人才基金項目（2013D005021000003）。

作者簡介薛飛燕（1982- ）， 女， 陜西吳堡人，講師，博士，從事生物質(zhì)能源相關研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事生物藥學方面的研究。

近年來因化學肥料和農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、耕地土壤品質(zhì)和生產(chǎn)力降低等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境惡化現(xiàn)象日趨嚴重[1]。為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、修復改善土壤環(huán)境和確保糧食安全供應，開發(fā)可替代傳統(tǒng)化學肥料的生物肥料（特別是微生物肥料）成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究熱點之一[2]。 微生物肥料又叫菌肥或接種劑等， 因含有大量微生物（包括芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌、微藻類等），可以完全替代或部分替代化學肥料在土壤中通過營養(yǎng)協(xié)作或生命活動而改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境[3-5]。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）因可以產(chǎn)生芽孢而具有較強的抗逆性和延長產(chǎn)品保存期的能力。有研究表明，它具有產(chǎn)生多種酶類、吸附重金屬和促進農(nóng)作物生長的能力。因而，它備受微生物肥料開發(fā)研究者的關注[3，6-7]。而有研究表明，粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）可以利用味精廢水、淀粉廢水、酒糟廢水和油脂廢水等有機廢水中的C源、N源及其他營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化為菌體及細胞內(nèi)含物[8-11]。蕓豆（Phaseolus vulgaris Linn.sp）學名菜豆，屬豆科的小宗雜糧作物，因具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值而受到人們的喜愛和醫(yī)學界的重視[12]。該研究是在證實粘紅酵母利用餐廚廢水轉(zhuǎn)化生物肥料并對豆科幼苗生長有一定促進作用的基礎上[13]，進一步研究了以餐廚廢水為原料通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得地衣芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌、粘紅酵母混合菌肥對蕓豆盆栽幼苗生長的影響，以期為生物肥料的深入研究提供基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1菌株。供試粘紅酵母、地衣芽孢桿菌原始菌株分別由北京化工大學譚天偉教授和楊建國客座教授惠贈。實驗室針對餐廚廢水經(jīng)過多次馴化篩選獲得供試菌株。

1.1.2蕓豆種子。市場購買籽粒飽滿的花蕓豆。

1.1.3培養(yǎng)基。粘紅酵母種子液培養(yǎng)基組成為葡萄糖40 g/L，磷酸二氫鉀7 g/L，硫酸鈉2 g/L，七水合硫酸鎂1.5 g/L，酵母粉1.5 g/L，硫酸銨2 g/L，pH 5.5。

地衣芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基組成為蛋白胨5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，酵母粉1.5 g/L，氯化鈉3.5 g/L，葡萄糖1 g/L，磷酸氫二鉀3.86 g/L，磷酸二氫鉀1.32 g/L，pH 7.0。

餐廚廢水取自北京農(nóng)學院學生食堂，經(jīng)過油水分離所得廢水分別添加5%葡萄糖（調(diào)節(jié)pH 5.5）和10%玉米淀粉（調(diào)節(jié)pH 6.5）獲得發(fā)酵培養(yǎng)基。滅菌后，分別接種粘紅酵母和地衣芽孢桿菌種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2試驗設計

1.2.1粘紅酵母菌體肥料的制備。廢水發(fā)酵過程是在5 L發(fā)酵罐（裝液量3 L）中進行，以10%（V/V）接種量接種粘紅酵母種子液。在發(fā)酵過程中，維持溫度30 ℃，pH 5.5，定時測定發(fā)酵液生物量和化學需氧量（COD）。發(fā)酵結(jié)束后，離心獲得菌體，80 ℃烘烤直至水分完全蒸發(fā)供肥效測試用。

1.2.2地衣芽孢桿菌菌體肥料的制備。廢水發(fā)酵過程是在5 L發(fā)酵罐（裝液量1.5 L）中進行，以10%（V/V）接種量接種地衣芽孢桿菌種子液。在發(fā)酵過程中，維持溫度37 ℃、pH 6.5，定時測定發(fā)酵液固含量和淀粉酶活力。發(fā)酵結(jié)束后，離心獲得固體物，80 ℃烘烤直至水分完全蒸發(fā)供肥效測試用。

1.2.3肥效測試的設計。取田間表層2～3 cm以下土壤，分別裝于口徑為20 cm的盆栽缽中。除對照外，每盆分別添加0.2 g菌體肥料（混合菌肥同時設計0.5 g/盆施肥量），然后播種已發(fā)芽的蕓豆種子（10粒/盆），在溫度為25 ℃、濕度為80%的人工氣候室培養(yǎng)，待出苗后保持蕓豆幼苗為5棵/盆，并且定期測定其株高和徑粗。

1.3測定項目與方法

1.3.1COD測定。用超純水稀釋培養(yǎng)液離心后上清液至COD快速測試儀的量程內(nèi)（<1 500 mg/L），利用消解儀148 ℃消解2 h后冷卻至室溫，最后利用比色計直接測定[9]。

1.3.2生物量（固含量）測定。發(fā)酵液水洗2～3次，離心、烘干至恒重，計算生物量（固含量，g/L）。

1.3.3高溫淀粉酶活力測定。按國標（GB82752009）測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果由圖1可知，粘紅酵母利用餐廚廢水培養(yǎng)5～15 h內(nèi)處于對數(shù)生長期，發(fā)酵24 h生物量可達10 g/L以上。在粘紅酵母對數(shù)生長期內(nèi)生長代謝旺盛，大量消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵液COD濃度呈明顯下降趨勢，發(fā)酵24 h后COD濃度可以降低35%。

2.2地衣芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果由圖2可知，地衣芽孢桿菌利用餐廚廢水發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵24 h后可以檢測到淀粉酶活力，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶的活力不斷增加，發(fā)酵60 h后可以增加到950 U以上，而在發(fā)酵過程中發(fā)酵液固含量有降低的趨勢。這主要是因為所添加水不溶物玉米淀粉不僅可以作為發(fā)酵生長的原料有所消耗，而且可以作為底物因產(chǎn)生淀粉酶而部分水解。

2.3單一菌肥對蕓豆豆苗生長的影響 餐廚廢水發(fā)酵培養(yǎng)粘紅酵母和地衣芽孢桿菌獲得菌體肥料后，以0.2 g/盆的施肥量分別進行蕓豆盆栽肥效測試，在蕓豆出苗、定苗后第5、8和10天分別檢測豆苗的徑粗和株高。由圖3可知，粘紅酵母和地衣芽孢桿菌以單一菌肥施用時，對徑粗增長均有促進作用，而粘紅酵母菌肥促進蕓豆豆苗徑粗增長更明顯，可以提高6%以上。由圖4可知，粘紅酵母菌肥和地衣芽孢桿菌菌肥對豆苗株高的增長均有較明顯的抑制效應，與對照相比地衣芽孢桿菌可以使豆苗株高降低25%以上。

2.4混合菌肥對蕓豆豆苗生長的影響餐廚廢水發(fā)酵培養(yǎng)粘紅酵母和地衣芽孢桿菌獲得菌體肥料后，分別以不同比例和不同施肥量進行了蕓豆盆栽肥效測試，并在蕓豆出苗、定苗后第5、8和10天分別檢測豆苗的徑粗和株高。由圖5A可知，粘紅酵母菌肥有助于蕓豆豆苗生長過程中徑粗的增長，當施肥量為0.2 g/盆，隨著豆苗生長時間的增加，粘紅酵母菌肥促進其徑粗增長作用越明顯，第10天的檢測結(jié)果與空白對照相比提高9%以上；由圖5B可知，增加混合菌肥的總施肥量（0.5 g/盆）對蕓豆豆苗生長的促進作用并沒有明顯提高，反而有減弱的趨勢。可見，使用該混合菌肥時，施肥量不宜過大，否則不但造成資源浪費，而且有可能出現(xiàn)肥害效應。由圖6可知，粘紅酵母菌肥和地衣芽孢菌肥均對蕓豆豆苗生長過程中株高的增長有抑制效應，而且隨著施肥量和地衣芽孢桿菌比例的增加，這種抑制效應表現(xiàn)得更加明顯，當施肥量為0.2 g/盆，粘紅酵母和地衣芽孢混合比例為4∶1圖5混合菌肥對蕓豆豆苗生長徑粗的影響圖6 混合菌肥對蕓豆豆苗生長株高的影響時，菌肥對豆苗株高增長的抑制作用較小。

3結(jié)論與討論

粘紅酵母在餐飲廢水中發(fā)酵培養(yǎng)可以積累菌體生物量，降低廢水COD濃度，地衣芽孢桿菌在餐飲廢水中發(fā)酵培養(yǎng)可以檢測到淀粉酶活性。這表明粘紅酵母和地衣芽孢桿菌具有資源化利用潛力，可以降低有機廢水濃度，減少對環(huán)境的污染；與傳統(tǒng)利用合成（或半合成）培養(yǎng)基的方法相比，以廢水為原料生產(chǎn)微生物菌體的方法可以大大降低生產(chǎn)成本[14-15]。

粘紅酵母和地衣芽孢桿菌作為生物菌肥單獨施用于蕓豆盆栽種植時，均表現(xiàn)為促進豆苗徑粗增長，而抑制豆苗株高增長的效應。粘紅酵母和地衣芽孢桿菌按照不同劑量、不同比例混合施用于蕓豆盆栽種植時的作用有所差異，但對豆苗株高的增長一致表現(xiàn)為抑制效應?；旌暇蕦χ参锷L的作用效果優(yōu)于單一菌肥的現(xiàn)象與相關研究中試驗結(jié)果[16-17]類似。粘紅酵母、地衣芽孢桿菌與其他生物肥料（如植物根基菌肥和根瘤菌肥）的作用相似[18-19]，對蕓豆幼苗徑粗增長有明顯的促進作用。研究表明，如果主要目標是追求生物菌肥對植物株高、徑粗等生長指標的綜合促進效應，那么可以在混合菌肥中增加粘紅酵母的比例。粘紅酵母和地衣芽孢桿菌的施用對蕓豆幼苗株高的影響不顯著甚至抑制的現(xiàn)象在復合菌肥應用于玉米[19]、物理刺激應用于大豆幼苗[20]、矮化劑作用于盆栽八寶景天[21]等研究中也觀察到了。蕓豆豆苗株高的增長受到抑制的作用可能是由于蕓豆幼苗受菌肥的影響后阻礙了植物體內(nèi)生長素的合成，或誘導乙烯等化合物增加。后續(xù)研究可以通過檢測生物菌體和所施用植株內(nèi)乙烯等化合物是否存在或含量高低，進一步揭示該生物菌體肥料的作用機理。同時，所研究生物菌肥對植株增粗、矮化的作用啟迪人們可以進一步研發(fā)具有抗倒伏等特效功能的生物肥料。

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