杉木無性系規(guī)模化組培繁育技術研究

王港　陳駿　侯娜　譚華美

摘 要： 為了建立高效的杉木規(guī)模化組培快繁體系，以杉木未木質(zhì)化的春梢莖段為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究不同生長調(diào)節(jié)劑及其濃度組合對莖段萌發(fā)和叢生芽增殖的影響。結果表明：采用未木質(zhì)化的春梢莖段，剖開后匍匐放置于培養(yǎng)基上，腋芽容易萌發(fā)，最佳初代培方式為MS+6BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，轉到MS+6BA0.8 mg/L+NAA0.3 mg/L繼續(xù)培養(yǎng)，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6BA0.8 mg/L+NAA0.3 mg/L，無根無菌植株采用常規(guī)扦插方法生根，可成功培育杉木優(yōu)良無性系苗木。

關鍵詞： 杉木；優(yōu)良無性系；無性繁殖；組織培養(yǎng)

中圖分類號：S722；S791.27 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2014）05-0007-04

杉木Cunninghamia lanceolata 杉科杉木屬常綠喬木，在中國南方廣泛分布，為中國特有的著名速生用材樹種，是中國南方最重要的造林樹種之一[1-4]。根據(jù)《中國森林資源報告——第七次全國森林資源清查》，中國現(xiàn)有杉木林面積1 126.87萬hm2，森林蓄積量73 409.48萬m3，其中人工林面積和蓄積量分別為853.86萬hm2、62 036.45萬m3，分別占中國人工林面積和蓄積比例的21.35%和31.64%，其面積和蓄積量均位居我國人工林首位，在中國民經(jīng)濟中占有重要的地位。

我國杉木組織培養(yǎng)研究起步較早，70年代就有杉木組培的相關報道，近年來，在杉木組培的愈傷組織誘導、芽及根系的分化、組培復壯等方面取得了一些研究成果[5-8]。但由于當前杉木組培苗生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)能力較低，嚴重限制了組培苗在生產(chǎn)上的應用[9-12]，同時也進一步限制了杉木優(yōu)良無性系的推廣應用。本文針對杉木組培苗木生產(chǎn)體系主要技術環(huán)節(jié)，尤其是對生產(chǎn)成本和效率起關鍵作用的芽增殖和煉苗移栽技術展開研究，為杉木組培苗木規(guī)?；a(chǎn)和杉木組培苗木高效生產(chǎn)體系建設起到積極作用，將進一步推進杉木無性系林業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料來源及處理

試驗材料為當年生尚未木質(zhì)化的嫩梢，采自貴州省黎平縣東風林場國家杉木良種基地二代收集圃。材料帶回室內(nèi)后，挑選無病蟲害和機械損傷的部分，清除泥污，剪成6 cm長莖段，流水沖洗1～2 h備用。

1.2 培養(yǎng)條件與預實驗

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25.0±2 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d，20 d后觀察誘導情況。預實驗結果：通過外植體初代預實驗發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基能較快誘導莖段腋芽萌發(fā)，WPM培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)較慢，將外植體剪成1 cm長小段，沿髓心剖開后，匍匐狀放置在培養(yǎng)基上，能夠較快、且能較多的誘導腋芽萌發(fā)；而將莖段豎直插入培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)較慢。故在后續(xù)實驗中均采用MS為基本培養(yǎng)基，材料采取沿髓心破開匍匐狀放置。

1.3 測定指標

培養(yǎng)15天后統(tǒng)計各個處理的腋芽萌發(fā)率、叢芽誘導率、增殖系數(shù)等指標。指標計算方法如下：

萌發(fā)率（%）=腋芽萌動數(shù)目/接種數(shù)（去除污染數(shù)）；愈傷誘導率（%）=誘導出愈傷組織的腋芽數(shù)目/接種的腋芽數(shù)目（去除污染數(shù)） ；叢芽誘導率（%）= 誘導出叢生芽的腋芽數(shù)目/接種的腋芽數(shù)目；增殖系數(shù)=誘導后的叢生芽的數(shù)目/誘導前芽的數(shù)目。

2 結果與分析

2.1 外植體最佳消毒方案研究

在參考前人試驗基礎上，確定以70%酒精浸泡30 s后轉到0.1% HgCl2浸泡5～8 min進行試驗見表1，結果表明：隨著HgCl2浸泡時間的加長，污染率快速下降，在試驗中還觀察到，隨著HgCl2浸泡時間的加長，外植體針葉黃枯情況也逐漸增加。綜合以上兩點，認為70%酒精處理30 S后0.1% HgCl2浸泡7 min為杉木外植體消毒最優(yōu)方案，通過該方案消毒后，外植體污染率為24%，且消毒后的外植體外形新鮮，生長正常。

2.2 腋芽萌發(fā)最佳激素濃度配比研究

通過誘導未木質(zhì)化外植體莖段腋芽萌發(fā)是本試驗獲取無菌植株的重要途徑。通過大量預試驗發(fā)現(xiàn)，當細胞分裂素6BA濃度為0.3～0.5 mg/L，生長素NAA濃度為0.1～0.5 mg/L時，莖段上的腋芽均能萌發(fā)，但萌發(fā)的速度和萌發(fā)后芽的長勢有較大差別。故在范圍內(nèi)分別將6BA和NAA設置成3個濃度梯度，做全因素試驗設計，試驗效果最好的初代激素濃度配比見表2，可以看出：誘導腋芽膨大最快的是6BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L的組合，莖段接種到該組合培養(yǎng)基上，僅需3天就能看到腋芽明顯膨大，該組合上腋芽萌發(fā)最為整齊，萌發(fā)平均時間最短；腋芽萌發(fā)后長勢最好的激素組合為6BA0.8 mg/L+NAA0.3 mg/L，鑒于以上情況，采取先將莖段接種到6BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，過10天左右（腋芽膨大，快要萌發(fā)時）轉接到6BA0.8 mg/L+NAA0.3 mg/L，這樣可以取得最佳的誘導效果。

2.3 不同激素處理對芽增殖的影響

杉木組培無菌苗增殖主要靠無菌苗腋芽的萌發(fā)。試驗發(fā)現(xiàn)，小幅度的生長素濃度變化對無菌苗腋芽萌發(fā)影響不明顯，故將生長素濃度固定為0.3 mg/L，細胞分裂素濃度由0.5～0.8 mg/L設置4個濃度梯度，進行全因素試驗見表3，可以看出：由于細胞分裂素濃度的不同，無菌苗腋芽萌發(fā)的時間、萌發(fā)的數(shù)量以及萌發(fā)后側芽的長勢都有明顯差異。觀察比較發(fā)現(xiàn)，6BA0.8 mg/L+IBA0.3 mg/L組合為杉木無菌苗增殖最佳激素配比，無菌苗在該組合培養(yǎng)基上7天腋芽就開始萌動，每個單芽分化出3～5個叢生芽，平均4.1個，且基部產(chǎn)生少量愈傷組織，苗生長粗壯。隨著在該組合培養(yǎng)基上，接種40天左右，萌發(fā)的腋芽長可達3.5 cm。在生產(chǎn)過程中，用口徑10 cm的玻璃瓶做培養(yǎng)容器，接種5根無菌苗，經(jīng)40天培養(yǎng)，每瓶可獲得15～25株無菌苗，生產(chǎn)效率得到很大提高。激素濃度配比在6BA1.0 mg/L+IBA0.3 mg/L的組合上雖有更高的增殖系數(shù)，但萌發(fā)后的腋芽長勢較弱，需進行復壯后才能繼續(xù)進行下一步培養(yǎng)。

2.4 無菌苗瓶外生根與管理

杉木組培較易生根，在增殖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)30天以上就有約70%的植株生根，但在瓶內(nèi)完成生根培養(yǎng)過程增加了成本，且苗木大小、品質(zhì)差異較大，本文結合杉木傳統(tǒng)扦插經(jīng)驗，采取無菌苗瓶外扦插生根的方式，不但簡化了生產(chǎn)程序和成本，而且培養(yǎng)的苗木規(guī)格質(zhì)量一致性也較好。

2.4.1 扦床處理

采用顆粒較細的砂質(zhì)壤土做扦插床，將土壤pH值控制在5～6之間，提前清除雜質(zhì)，防治土壤害蟲，用多菌靈或者0.1%的高錳酸鉀進行土壤消毒，將土塊盡量打細、平整床面。

2.4.2 插穗選擇與扦插

挑選長大于3.0 cm，木質(zhì)化程度較高的無菌苗作為扦插材料；扦插時將插穗垂直插入苗床中，插入深度為入土部分2 cm左右，若暫時不進行移栽，就在原苗床培養(yǎng)苗木，株行距控制在10 cm×15 cm，若要進行移栽，可將株行距控制在3 cm×5 cm。

2.4.3 扦插后管理

扦插后的苗床要求濕度控制在70%左右，溫度控制在25～30 ℃。在海拔較低地區(qū)采用遮陽網(wǎng)加噴霧保濕降溫設施，在高海拔地區(qū)采用遮陽網(wǎng)加小拱棚。

插穗扦插后，20 d左右開始形成根原基，35 d左右可見到根生出；扦插40 d左右頂部萌發(fā)出新芽并開始抽梢，此時可噴灑葉面肥，加快新梢生長。

3 結果與討論

細節(jié)決定成敗。本試驗的成功主要是將莖段沿髓心剖開后匍匐放置在培養(yǎng)基上，試驗過程中發(fā)現(xiàn)，豎直插入培養(yǎng)基中的材料，無頂芽的莖段基部有褐化現(xiàn)象，經(jīng)過25天培養(yǎng)后腋芽開始膨大，帶頂芽的莖段在培養(yǎng)45天后仍無明顯生長跡象。莖段破開后匍匐放置，不僅沒有褐化現(xiàn)象，而且腋芽在3天即可觀察到膨大，腋芽都能萌發(fā)，杉木豐富的腋芽加上該處理方法，接種少數(shù)外植體可在第一時間內(nèi)獲取大量無菌材料，加快了杉木優(yōu)良無性系的擴繁。

木本植物組培多重視腋芽的培養(yǎng)。組培外置體選擇時，有些人選擇正在生長的頂芽作為外植體，頂芽作為外植體弊端較多，一是材料少，植株的頂芽數(shù)量有限，二是頂芽不易消毒，生長中的頂芽往往葉片密集，是藏較多污垢的死角，消毒時不易徹底殺死病菌，三是在消毒過程中容易損傷生長點，正在生長的頂芽生長點暴露在外，消毒劑直接接觸生長點，在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)畸形。相比之下，腋芽沒有這些弊端，在對花椒、核桃、光皮樺、夾竹桃、杉木等的組培研究中[13-19]，均通過腋芽的培養(yǎng)獲得了正常生長的無菌植株。

參 考 文 獻

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（責任編輯：鄭京津）