骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Wnt信號(hào)通路的作用研究

徐思慧 宋春敬 孟海建 范英昌

摘 要：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derved mesenchymal stem cells，BM-MSCs）具有多向分化潛能，可以應(yīng)用于修復(fù)細(xì)胞、組織、器官的損傷，通過干細(xì)胞移植療法治療多種疾病。BM-MSCs在一定的條件下可以誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CMs），為治療心血管疾病帶來了希望。在心臟的分化過程中，Wnt信號(hào)通路發(fā)揮著非常重要的作用，因此對(duì)BM-MSCs分化為CMs過程中Wnt信號(hào)通路所發(fā)揮的作用做一簡(jiǎn)述。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌細(xì)胞；Wnt信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：Q782

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007 7847（20l4）06-0539-04

心血管疾病發(fā)病率高，危害性大，是當(dāng)今威脅人類健康最重要的疾病。所有的心肌疾病，特別是心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞（CMs）的死亡，進(jìn)而引起心臟衰竭。CMs 一旦死亡就無法再生，而BM-MSCs是一種具有自我更新、增殖和定向分化為中胚層、內(nèi)胚層、神經(jīng)外胚層來源的多潛能干細(xì)胞，可以分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞等，可以應(yīng)用于修復(fù)細(xì)胞、組織、器官的損傷，將BM-MSCs作為CMs的來源，為CMs再生的發(fā)展帶來了新的希望。Wnt信號(hào)通路參與心臟分化過程，并發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用，因此以下就主要探討B(tài)M-MSCs分化為CMs過程中Wnt信號(hào)通路所發(fā)揮的作用。

1 BM-MSCs向CMs分化及應(yīng)用

隨著心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，運(yùn)用BM -MSCs，治療心血管疾病日益受到人們的廣泛關(guān)注。Nadia等分別用5-氮雜胞苷（5 -azacyti-dine， 5-aza）和zebularine在體外誘導(dǎo)BM-MSCs并與CMs以2：1的比例共同培養(yǎng)，經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，經(jīng)處理過的BM-MSCs分化出類似CMs形態(tài)的細(xì)胞，在相鄰細(xì)胞間形成肌管樣結(jié)構(gòu)，并表達(dá)心肌特異性基因GATA4和Nkx2.5，以及心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T （cardiac troponin T，cTnt），證明經(jīng)5 -aza和zebularine處理過的BM-MSCs可分化出心肌樣細(xì)胞。

Nagaya等將用紅色熒光染料PKH26標(biāo)記的BM-MSCs注射到擴(kuò)張型心肌病大鼠的心肌中，移植后的BM-MSCs可表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物cTnT，結(jié)蛋白，連接蛋白-43，并且移植BM-MSCs后明顯增加了毛細(xì)血管密度，并降低左心室舒張末期壓力，增加等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率，從而改善擴(kuò)張型心肌病大鼠的心功能。用流式細(xì)胞儀分析離體的心臟細(xì)胞，僅有（8±l）%的BM -MSCs表現(xiàn)為PKH26和cTnT雙陽性，表明移植后的BM-MSCs僅有少數(shù)可以分化CMs。此外，Wang等通過結(jié)扎21只SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型，結(jié)扎一周后，18只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組直接用PKH26標(biāo)記的BM-MSCs的磷酸鹽緩沖液注射到梗死的心肌，3只大鼠只接受磷酸鹽緩沖液，另3只未結(jié)扎的大鼠作為對(duì)照組，培養(yǎng)6周后，在注射BM-MSCs的大鼠可觀察到PKH26標(biāo)記的跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞，收縮力與正常CMs相同，射血分?jǐn)?shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

2 Wnt信號(hào)通路

Wnt家族可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的許多不同的方面，在哺乳動(dòng)物基因組中存在19個(gè)Wnt基因。Wnt蛋白是果蠅無翅基兇的同源物，富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白。Wnt信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞的極性等。目前Wnt信號(hào)通路至少有4種信號(hào)通路：經(jīng)典Wnt通路（wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路）、Wnt/Ca2+信號(hào)通路、Wnt/PCP （planarcell polarity，PCP）信號(hào)通路、調(diào)節(jié)紡錘體定向和不對(duì)稱絀胞分裂的通路。

2.1 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路

經(jīng)典Wnt通路的關(guān)鍵步驟就是β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的水平。在無Wnt信號(hào)刺激時(shí)，β-catenin一方面可以與結(jié)腸腺瘤樣息肉基因編碼的蛋白（adenomatous polyposis coli， APC）、軸蛋白（Axin）、糖原合成酶激酶-3 （glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、酪蛋白激酶 I（casein kinase 1.CKl）和E3泛素連接酶β-TRCP形成復(fù)合物，GJSK-3促進(jìn)β-catenin磷酸化，繼而被β-TRCP識(shí)別泛素化降解，蛋白磷酸酶2A （protein phosphatase 2A，PP2A）可抑制復(fù)合物的形成和β-catenin的降解。另一方面大量的β-catenin與 E-鈣粘蛋白（E-cad—herin）形成復(fù)合物穩(wěn)定在細(xì)胞膜上，作為一種肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)蛋白，并介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附。當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí)，通常由Wntl、Wnt2a、Wnt3a、Wnt8a等激活，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過Wnt蛋白結(jié)合卷曲蛋白（frizzled， FZD）家族的受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 （low den-sity lipoprotein receptor-related protein 5.LRP5）或LRP6受體激活細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt-FZD-LRP6形成的復(fù)合物與被激活的具有支架蛋白作用的散亂蛋白 （dishevelled， DVL）使LRP6磷酸化并使Axin介導(dǎo)的β-catenin磷酸化受到抑制，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞核內(nèi)與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（T-cell factor/Lymphoid enhancing factor，TCF/LEF）結(jié)合形成復(fù)合物并激活Wnt靶基因的表達(dá)。Wnt信號(hào)通路具體過程見圖l。當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)缺乏β-catenin時(shí)，TCF可以與轉(zhuǎn)錄輔阻遏物C一終端一結(jié)合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）結(jié)合，從而抑制Wnt信號(hào)。同時(shí)Gro通過與β-catenin重疊的結(jié)合位點(diǎn)使轉(zhuǎn)錄抑制。

2.2 WnUCa2+信號(hào)通路

當(dāng)Wnt4、Wnt5a、Wntll激活Wnt/Ca2+信號(hào)通路，Wnt蛋白可以與FZD結(jié)合通過G蛋白激活磷脂酶C （phospholipase C，PLC）生成二酰甘油（dia-cylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol trisphos-phate，IP3），DAG和IP3使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道開放釋放鈣離子，從而增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加。同時(shí)Wnt/FZD也町激活磷酸二酯酶6（phosphodiesterases6，PDE6）水解環(huán)磷酸鳥苷（cycliC guanosine monopllosphate， cGMP），從而消耗細(xì)胞內(nèi)的cGMP，使細(xì)胞內(nèi)的Caz+濃度增加。隨著鈣離子濃度的增加，鈣調(diào)蛋白大量表達(dá)激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-de-pendent protein kinase 2，CaMKⅡ）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），因而激活各種調(diào)節(jié)蛋白而發(fā)揮作用。

2.3 WnUPCP信號(hào)通路

Wnt/PCP信號(hào)通路是通過激活RhoA、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和nemo 樣激酶（nemo-like kinase， NLK）引發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。人類PCP的核心信號(hào)分子是VAN-GL1、VANGL2、CELSRl、CELSR2、CELSR3、DVL1、DVL2、DVL3、PRICKLEl、PRICKLE2和ANKRD6。在脊椎動(dòng)物中，Wnt/PCP信號(hào)通路由非經(jīng)典的Wnt5a、Wnt5b、Wnt11介導(dǎo)，而不是通過β-catenin介導(dǎo)，非經(jīng)典的Wnt信號(hào)與FZD受體結(jié)合并激活細(xì)胞質(zhì)骨架蛋白DVL和三聚體G蛋白，DVL、散亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子-l（disllevelled as-sociatied activator of morphogenesis-1， Daaml）、RhoA形成復(fù)合物激活RhoA蛋白，從而導(dǎo)致Rock激酶活化和MRLC磷酸化。DVL與Rac1形成的復(fù)合物可激活JNK來發(fā)揮作用。

2.4 調(diào)節(jié)紡錘體定向和不對(duì)稱細(xì)胞分裂的通路

目前對(duì)于調(diào)節(jié)紡錘體定向和不對(duì)稱細(xì)胞分裂的通路研究棚對(duì)較少。Wnt信號(hào)通路的一些分子如GSK-β，APC參與某些牛物如果蠅和線蟲細(xì)胞分裂過程中紡錘體方向的確定和非對(duì)稱細(xì)胞分裂。

3 Wnt信號(hào)通路與CMs分化的關(guān)系

在瓜蟾原腸胚形成過程中早期短暫激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)心臟發(fā)牛沒有產(chǎn)生影響，但持續(xù)激活或在原腸胚形成之后該途徑可抑制CMs分化。為研究經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)于哺乳動(dòng)物CMs的分化作用，Naito等將小鼠胚胎干細(xì)胞（embryon-ic stem cell， ES）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)早期擬胚體（embryoid body，EB）階段通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)EB細(xì)胞分化為CMs，而在中后期，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制CMs分化。在人類中，在早期需要激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向CMs分化，而在后期下調(diào)β-catenin抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路有利于心臟重塑。因此在CMs分化過程中，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路具有雙向調(diào)節(jié)作用，在早期發(fā)揮促進(jìn)作用，在中后期發(fā)揮抑制作用。

最近研究證實(shí)Wnt5a和Wnt11通過抵制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下調(diào)β-catein，共同促進(jìn)ES向心肌祖細(xì)胞分化，是心臟形成和發(fā)育過程中不可或缺的一部分，若Wnt5a和Wnt11缺失，可使經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活，心臟發(fā)育受到嚴(yán)重?fù)p害。此外Wnt2通過非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路而激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)小鼠ES分化為CMs，去除Wnt2抑制 ES向CMs的分化，加入外源性Wnt2可以糾正，但是加入的時(shí)間受到限制。所以非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)CMs分化。

4 Wnt信號(hào)通路在BM -MSCs分化為CMs的作用

4.1 Wnt信號(hào)通路與BM-MSCs增殖的關(guān)系

Karow等不同濃度的Wnt3a轉(zhuǎn)導(dǎo)人鼠BM -MSCs，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β一catenin積累，使β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)遷移激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，使與BM-MSCs增殖密切相關(guān)的Wnt11目的基因cyclin Dl得以表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BM-MSCs增殖，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最佳的Wnt3a濃度為150 ng/mL。若將siRNAs（可拮抗β-catenin）導(dǎo)入BM-MSCs，與未導(dǎo)入SiRNAs的對(duì)照組相比，使β-catenin和cyclin DlmRNA的表達(dá)明顯降低。同樣在人BM-MSCs中，Wnt3a可以促進(jìn)BM-MSCs的增殖，并|且可以增強(qiáng)BM-MSCs的遷移和侵襲能力，如果加入干擾β-catenin和LRP5的RNA或去除β-catenin或LRP5，均能使目的基因cyclin Dl轉(zhuǎn)錄受損，使BM-MSCs增殖能力和侵襲能力顯著減弱。與此同時(shí)為了評(píng)估經(jīng)Wnt3a處理未分化的RM-MSCs是否保持著祖細(xì)胞的特性和功能，誘導(dǎo)獲得的BM-MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，這些細(xì)胞仍顯示Ca2+沉積或細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡的堆積，說明Wnt3a不影響B(tài)M-MSCs的細(xì)胞特性和功能。所以Wnt3a通過激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)BM-MSCs增殖，增強(qiáng)BM-MSCs的遷移和侵襲能力，同時(shí)保持著BM-MSCs多向分化能力。

4.2 Wnt信號(hào)通路與BM -MSCs分化為CMs的關(guān)系

He等在研究轉(zhuǎn)導(dǎo)Wntll是否能直接增加BM-MSCs分化為心肌表型的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組將Wnt11和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉(zhuǎn)導(dǎo)入BM-MSCs，對(duì)照組只將GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)入BM -MSCs，為了鑒定細(xì)胞融合情況，將兩組的BM-MSCs以1：40的比例與剛出生1—3d的SD大鼠CMs混合培養(yǎng)7 d，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組心肌特異性基因表達(dá)產(chǎn)物GATA-4、腦尿鈉肽（brain naLriuret-ic peptide，BNP）、islet-l和α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）高于對(duì)照組，并且在BM-MSCs與被PKH26標(biāo)記的CMs之間發(fā)現(xiàn)了連接蛋白-43。 Wntll大量表達(dá)顯著提高了BM-MSCs心肌標(biāo)志物的表達(dá)，并在共培養(yǎng)過程中促進(jìn)了BM-MSCs分化為心肌細(xì)胞表型。

在此基礎(chǔ)上，Zuo等展開了導(dǎo)入Wnt11的BM-MSCs是否可改善急性心肌缺血的研究，將實(shí)驗(yàn)分為5組，假手術(shù)控制組和4組急性心肌梗死大鼠接受不同的治療：在缺血的心肌邊緣分別注射50μL的培養(yǎng)基，50μL含l.5x10 6個(gè)細(xì)胞的MSCWnt11 （將Wntll和GFP導(dǎo)入BM -MSCs），MSCNull（將GFP導(dǎo)入BM-MSCs）和MSCbas（未經(jīng)任何轉(zhuǎn)導(dǎo)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在缺血的心肌中，Wnt11顯著增加了BM-MSCs在缺血心肌中的存活率，相比于其他組MSCWnt11組左心室縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)明顯改善，Masson三色染色和TUNEL染色顯示MSCWntll組心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡明顯減少，說明心臟功能的改善與MSCWnt11注射人心肌成正相關(guān)。

相關(guān)研究均支持這一結(jié)論，Wnt11能抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)BM-MSCs向CMs分化。

5 展望

在當(dāng)今社會(huì)，心血管疾病不僅給社會(huì)和家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且也嚴(yán)重危害了個(gè)人的身體健康。一直以來研究人員都在尋求治療心血管疾病的最佳方法，可以改善心血管功能，防治心血管疾病。BM-MSCs取材方便，在體外培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單方便，并且具有多向分化潛能，有很大的可塑性和治療應(yīng)用潛力，為治療心血管疾病帶來了希望。研究BM-MSCs分化為CMs過程中的Wnt信號(hào)通路，為BM-MSCs應(yīng)用于治療心血管疾病打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在不久的將來，BM-MSCs定會(huì)在心血管領(lǐng)域有新的突破。