番茄響應(yīng)生物脅迫相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展

崔娟娟 欒雨時(shí)

摘 要：miRNA（microRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約22nt的非編碼小RNA分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等過(guò)程。近年來(lái)，通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)兩種方法，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些響應(yīng)病毒、真菌和共生真菌脅迫的番茄miRNA。這些miRNA的研究以及amiRNA（artificial miRNA）技術(shù)的應(yīng)用，將為番茄乃至其他植物病害的防治提供新的契機(jī)。

關(guān)鍵詞：番茄；生物脅迫：miRNA：amiRNA

中圖分類(lèi)號(hào)：Q74

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）06-0533-06

miRNA是一類(lèi)在真核生物中普遍存在的非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控真核生物的基因表達(dá)。在細(xì)胞核中，miRNA基因轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA，經(jīng)DCL1（dicer-like l）加工后生成具有發(fā)火結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，它被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核后形miRNA/miRNA A*，雙鏈解旋形成成熟的miR-NA.隨后miRNA與AGO（Argonaute）等蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC（RNA -in-duced silengcing complex），從而在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)翻譯阻遏或降解機(jī)制發(fā)揮調(diào)控作用。miRNA的種類(lèi)繁多、分布廣泛，于轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，在多種生物中得到廣泛研究，截至2013年6月，miRBase Release 20（http：//www.mirbase.org/）中已經(jīng)收錄了24 521條miRNA成熟序列，主要集中在人、小鼠、擬南芥、水稻等模式生物中，而番茄中儀收錄了46條，miRNA不僅調(diào)控番茄的根、莖、葉及果實(shí)發(fā)育，還參與番茄的新陳代謝、激素途徑、牛物和非生物脅迫響應(yīng)等過(guò)程近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中于挖掘并探究生物脅迫相關(guān)的番茄miRNA。生物脅迫下，每個(gè)番茄miRNA的表達(dá)模式都存在差異，它們的靶基因變化趨勢(shì)與 miRNA的變化趨勢(shì)有時(shí)相反，有時(shí)相同。深入研究這些miRNA的作用機(jī)制及功能將為植物病害防治提供新的思路。本文概述了挖掘生物脅迫相關(guān)miRNA的方法，系統(tǒng)地闡述了miRNA在番茄響應(yīng)病毒和真菌脅迫過(guò)程中所發(fā)生的變化，討論了amiRNA在提高番茄抗病性中的最新研究進(jìn)展，并對(duì)miRNA在植物抗病研究中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 生物脅迫相關(guān)miRNA的挖掘

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是挖掘miR-NA的兩種主要方法。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)包括基因芯片和高通量測(cè)序兩種技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是將已知miRNA固定在芯片介質(zhì)上，依據(jù)堿基互補(bǔ)原理挖掘miRNA的一種方法。由于該方法具有快速、準(zhǔn)確和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此，在挖掘生物脅迫相關(guān)miRNA時(shí)被廣泛應(yīng)用。如Jin等用芯片技術(shù)檢測(cè)到了3個(gè)與灰霉病菌脅迫相關(guān)的番茄miRNA。高通量測(cè)序技術(shù)主要是通過(guò)構(gòu)建小RNA文庫(kù)，根據(jù)堿基序列長(zhǎng)度、前體結(jié)構(gòu)、最小自由能等參數(shù)進(jìn)行篩選，獲得候選miRNA的一種手段。該技術(shù)具有準(zhǔn)確性、可靠性和通量高等優(yōu)點(diǎn)，也是挖掘生物脅迫相關(guān)miRNA的常規(guī)手段之一。如Chen等用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到了33個(gè)與病原菌脅迫密切相關(guān)的楊樹(shù)miRNA。隨著生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展和各物種基因組信息的逐步完善，高效、經(jīng)濟(jì)的牛物信息學(xué)控掘也成了發(fā)現(xiàn)生物脅迫miRNA的重要手段。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是依據(jù)miRNA的成熟體及前體特征，在EST、GSS及基因組序列中預(yù)測(cè)潛在的miRNA的一種方法。此方法已在馬鈴薯、糜子、桃等物種中得到成功應(yīng)用。結(jié)合miRNA啟動(dòng)子、靶基因功能分析，能夠預(yù)測(cè)候選miRNA的功能。通過(guò)生物信息學(xué)手段很有可能找到和生物脅迫密切相關(guān)的miRNA，但由于缺乏驗(yàn)證，更多的研究有待深入。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)兩種方法各有優(yōu)劣，越來(lái)越多的研究已將二者結(jié)合，這也將成為未來(lái)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵病害相關(guān)miRNA的強(qiáng)大手段。

2 番茄miRNA與生物脅迫

番茄在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遇到多種牛物脅迫，因此.它也是研究植物與微生物互作的模式材料之一。 隨著基因芯片、高通量測(cè)序和生物信息學(xué)預(yù)洲等技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多響應(yīng)生物脅迫的番茄miRNA被發(fā)現(xiàn)，它們的表達(dá)在番茄響應(yīng)病毒、真菌和共生真菌的過(guò)程中發(fā)生著不同程度的變化，現(xiàn)歸納于表1。

2.1 番茄miRNA與CMV和TAV

2.1.1 番茄miRNA與CMV和TAV脅迫

CMV （cucumher mosaic virus）是寄主范圍最廣、影響最大的植物病原物之一。Lang等用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了12個(gè)番茄miRNA與CMV脅迫應(yīng)答相關(guān)。TAV （tomato aspermv virus）與CMV的基因組同源性很高，二者共屬黃瓜花葉病毒屬，但有不同的寄主和植株感病癥狀。為探究番茄miRNA如何響應(yīng)CMV和TAV脅迫，F(xiàn)eng等選擇了miR159、miR162、miR164、miR165/166、miR-167、m1R168和m1R17l共7個(gè)與番茄生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和miRNA自身形成相關(guān)的miRNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上述兩種病毒處理后，這7個(gè)miRNA的表達(dá)差異明顯，暗示這些miRNA可能參與番茄響應(yīng)CMV和TAV的脅迫過(guò)程。

為深入探索其內(nèi)在機(jī)制，F(xiàn)eng等進(jìn)一步研究了CMV和TAV脅迫下番茄miRNA在不同處理時(shí)間后的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)變化各不相同。miR159、miR162、miR168和miR171在脅迫處理后異常表達(dá)，而miR164、miR165/166和miR167的變化甚微。在第10 d時(shí)CMV處理組較TAV處理組的miRNA有更高的表達(dá)量，第20d時(shí)兩者相差不多，第30 d時(shí)TAV處理組表達(dá)量更高。此外，miR168在CMV處理后第10 d的表達(dá)量是對(duì)照的15.2倍，miR162在TAV處理后第30 d的表達(dá)量是對(duì)照的4.5倍。

miRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，研究表明，生物脅迫處理后參與番茄生長(zhǎng)發(fā)育的miRNA異常表達(dá)，這一現(xiàn)象與生物脅迫后番茄葉、果實(shí)和根等組織的病變有關(guān)。Feng等用CMV和TAV處理番茄的花和果實(shí)，發(fā)現(xiàn)在不同組織和協(xié)迫時(shí)期，與發(fā)育相關(guān)的miRNA異常表達(dá)。如，miR159主要在蕾期、開(kāi)花期及果實(shí)發(fā)育早期；miR160在果實(shí)成熟期；miR167在開(kāi)花及果實(shí)直徑達(dá)1～5 mm的時(shí)期；miR172在蕾期及開(kāi)花期。這些miRNA的異常表達(dá)可能誘發(fā)了脅迫處理后花和果實(shí)的病變。

基于以上進(jìn)展，F(xiàn)eng等又研究了 CMV和TAV脅迫下，l1個(gè)番茄miRNA在根和莖中的表達(dá)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)特性各不相同。經(jīng)CMV-Fny-satT1（加重病癥的CMV）和TAV處理21 d，番茄莖部會(huì)分別出現(xiàn)中空和纖維化現(xiàn)象。其中，兩種脅迫處理后miR156都表達(dá)異常，而過(guò)表達(dá)miR156a的轉(zhuǎn)基因番茄會(huì)出現(xiàn)莖髓消失，與CMV和TAV誘發(fā)的莖中空及纖維化現(xiàn)象類(lèi)似。因此，miR156的異常表達(dá)可能導(dǎo)致了番茄莖部的病變此外，經(jīng)CMV和TAV脅迫處理的番茄，側(cè)根數(shù)明顯減少，而ARF （auxin response factor）與植物的側(cè)根發(fā)育相關(guān)，研究中以ARF為靶基因的miR160、miR164和miR167均發(fā)生了異常表達(dá)的現(xiàn)象，說(shuō)明它們誘發(fā)了番茄側(cè)根數(shù)量的減少。

2.1.2

番茄miRNA與CMV的沉默抑制子

CMV的基因組編碼5個(gè)ORF，包括la、2a、2b、3a和3 b：其中，2b是最重要的致病蛋白，也是CMV的沉默抑制子，通過(guò)抑制沉默途徑的關(guān)鍵因子AGO蛋白活性，在病毒逃避植物免疫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Feng等的研究表明，miR168及其靶基因AGO在CMV和TAV處理番茄后，均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的矛盾現(xiàn)象。然而在2h突變病毒株的處理下，相應(yīng)的番茄miRNA的表達(dá)量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。說(shuō)明2b在干擾番茄利用miRNA抵御CMV的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。其機(jī)制可能是2h抑制了AGO對(duì)miRNA靶基因的切割活性，導(dǎo)致靶基因大量累積，最終出現(xiàn)CMV和TAV脅迫下番茄miRNA及靶基因的表達(dá)整體上調(diào)的矛盾現(xiàn)象。

2.1.3 番茄miRNA與CMV的衛(wèi)星RNA

一些CMV株系能夠用病毒殼體包裹小的自剪接RNA分子，形成satRNA（satetlite RNA），它必須依賴(lài)于輔助病毒進(jìn)行侵染和復(fù)制。satRNA在CMV中以不同的突變體形式存在，可以改變植物病癥。據(jù)Feng等報(bào)道，在CMV和TAV脅迫下，11個(gè)miRNA及相應(yīng)的靶基因發(fā)生了不同程度的異常表達(dá)一然而，當(dāng)向CMV導(dǎo)入減弱病癥的satRNA時(shí)，這些miRNA的變化不明顯。與此相反，當(dāng)導(dǎo)入攜帶有加重病癥的satRNA時(shí)，番茄的miRNA又發(fā)生異常表達(dá)的現(xiàn)象。該研究暗示了satRNA在CMV 干擾番茄miRNA調(diào)控中的復(fù)雜作用。

2.2 番茄miRNA與ToLCV

ToLCV（ tomato leaf curl virus）是一類(lèi)雙生病毒，該類(lèi)病毒變異速度快，寄主范圍廣，常給熱帶或亞熱帶國(guó)家和地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大影響。Naqvi等用芯片技術(shù)檢測(cè)到13個(gè)與ToLCNDV（ tomato leaf curl new delhi virus）相關(guān)的番茄miRNA，它們的靶基因表達(dá)趨勢(shì)與之相反。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ToLCNDV處理后，多種不同番茄資源材料中的miR159/319和miR172異常表達(dá)，且這三者與葉片發(fā)育密切相關(guān)，因此，推測(cè)它們?cè)赥oLCNDV脅迫后的異常表達(dá)可能導(dǎo)致了番茄卷葉癥狀。

ToLCV以單分子DNA-A或兩分子DNA-A、DNA-B閉環(huán)狀ssDNiA的方式存在。DNA-A的正義鏈編碼AV1和AV2，互補(bǔ)鏈編碼AC1、AC2、AC3、AC4，共有6個(gè)ORF。 AC1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白，AC2編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白，AC3編碼復(fù)制增強(qiáng)子蛋白，AC4編碼癥狀表達(dá)決定性的蛋白。DNA-B編碼BC1和BV1，前者促進(jìn)病毒在細(xì)胞間的傳播，后者使新形成的病毒基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。為研究番茄的miRNA是否能夠靶向病毒基因，從而抑制病毒增殖，Naqvi等用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到9個(gè)番茄miR/miR*序列與ToLCV的6個(gè)不同的ORF有很高的序列匹配性。其中miR164a、miR169b*、m1R169d和miR171*靶向ToLCV的外殼蛋白14 V1基因，miR164和miRl69b*在，AVI處有交叉結(jié)合位點(diǎn)。4個(gè)miR/miR*靶位點(diǎn)都相對(duì)較近，它們可能協(xié)同作用，導(dǎo)致高效的AV1靶基因沉默。研究還發(fā)現(xiàn)一些miR*，可能也參與了抑制病毒生長(zhǎng)的過(guò)程，如miR156*靶向AC2、AC3，miR172*靶向AV2等，這些均揭示了miR*在植物抗病中的新角色。

2.3 番茄miRNA與灰霉菌

灰霉病是導(dǎo)致番茄莖腐爛的重要病害之一，常造成栽培番茄的減產(chǎn)。Jin等用基因芯片技術(shù)檢測(cè)到番茄miR169、m1R160和miR171a與灰霉病菌脅迫相關(guān)。在病菌處理后12 h，miR169上調(diào)表達(dá)，miR160和miR171a下調(diào)表達(dá)、其中，miR169的靶基因下調(diào)表達(dá)，而miR171a和miR160的靶基因均上調(diào)表達(dá)。啟動(dòng)子分析表明，miR169的啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)與許多植物基因病原誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件-Box-Wl，該區(qū)域也是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點(diǎn)，參與創(chuàng)傷響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控，且miR169的啟動(dòng)子區(qū)存在創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif暗示miR169可能受控于轉(zhuǎn)錄因子，參與了創(chuàng)傷響應(yīng)途徑。

2.4 番茄miRNA與叢枝菌根

叢枝菌根是叢枝菌根真菌與植物根部組織長(zhǎng)期進(jìn)化形成的共生菌根，它在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抵御不良環(huán)境中發(fā)揮著積極作用，是與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)關(guān)系最為密切的菌根之一。Gu等用基因芯片技術(shù)研究了番茄miRNA與叢枝菌根的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)miR395、miR779.1、miR840和miR867在有叢枝菌根的番茄葉片中特異性表達(dá)，miR158、miR862-3p、miR319、miR394和miR399在有從枝菌根的番茄根部異常表達(dá)這些都暗示了miRNA在番茄與叢枝真菌共生過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。

2.5 其他

Shivaprasad等通過(guò)分析番茄小RNA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)番茄中存在miRNA介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)式訓(xùn)控，該調(diào)控途徑參與番茄抗病過(guò)程。啟動(dòng)級(jí)聯(lián)調(diào)控的miRNA超家族包括miR482和miR2118等。它們廣泛存在于各種植物中。雖然miR482和miR2118家族成員之間序列差異大，但都是以包括NBS（NUCLEOTIDE-BINDING SITE）和LRR（ leucine-rich re-peat）在內(nèi)的植物抗病基因家族為靶基因。其中，miR482通過(guò)降解NBS-LRR而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在番茄抗病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Li等預(yù)測(cè)到miR482a、miR482b、miR482c和 miR482d在番茄染色體上成簇存在，暗示了它們可能協(xié)同作用響應(yīng)生物脅迫。而miR6022、miR6023、miR6024、miR6026和miR6027的靶基因多為番茄抗病基因，更進(jìn)一步表明該miRNA家族在番茄響應(yīng)生物脅迫中的重要作用。以上與生物脅迫相關(guān)的miRNA，都可被選作候選miRNA分子，進(jìn)行深入的致病分子機(jī)制研究和功能分析。

3 amiRNA在番茄抗病中的應(yīng)用

隨著miRNA的生成及作用機(jī)理研究的日漸深入，針對(duì)病原物基因設(shè)計(jì)人工miRNA的技術(shù)也隨之產(chǎn)生。miRNA是為了在生物體內(nèi)控制某一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，根據(jù)天然miRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制，通過(guò)人工設(shè)計(jì)構(gòu)建、轉(zhuǎn)導(dǎo)并在生物體內(nèi)表達(dá)而產(chǎn)生的目的miRNA，是調(diào)控靶基因表達(dá)的一項(xiàng)新的生物技術(shù)。Qu等利用miR171a的前體骨架，構(gòu)建了以CMV沉默抑制子26為靶基因的amjRNA，導(dǎo)入后的轉(zhuǎn)基因煙草能夠有效抵御CMV，并且amiRNA表達(dá)量越高，轉(zhuǎn)叢因煙草對(duì)CMV的抗性越強(qiáng)。Niu等利用擬南芥miR159前體骨架成功地構(gòu)建廠(chǎng)兩個(gè)分別以TYMV（ turnip yellow mosaic virus）和TuMV （turnip mo-saic- virus）沉默抑制子為靶基因的amiRNA，兩組轉(zhuǎn)基因植株都能夠有效抵御TYMV和TuMV的危害。該研究還發(fā)現(xiàn)，同時(shí)導(dǎo)入這兩個(gè)amiRNA的轉(zhuǎn)茵番茄對(duì)TYMV和TuMV有100%的抗性。這些以病毒關(guān)鍵致病基因?yàn)榘谢虻腶miRNA都可以和正常miRNA一樣在植物體內(nèi)產(chǎn)生、成熟并發(fā)揮作用，使植物獲得抗病特性，并且穩(wěn)定遺傳給子代。Zhang等利用南芥miR159前體骨架，設(shè)計(jì)了兩個(gè)amiRNA構(gòu)件，一個(gè)是amiR-2a/b：5-UUGGAGUUCGACGUUUGUCAU -3'，靶向CMV 2α （RNA依賴(lài)的RNA聚合酶蛋白基因）和2b疊基基因，另一個(gè)amiR一3UTR：5 -UGAC-CAUUUUAGCCGUAAGCU-3，靶向CMV基因的保守區(qū)域3'UTR。將這兩個(gè)amiRNA導(dǎo)人番茄，得到了能夠抵抗CMV、TMV （tobacco mosaic virus）和TYLCV （ tomato yellow leaf curl virus）等病毒的植株，并且靶向2α和2b的amiRNA，對(duì)CMV抑制效果達(dá)85.7%～100%。另外，Vu等也在番茄中成功地構(gòu)建并導(dǎo)入了兩個(gè)針對(duì)ToLCNDV的amiRNA載體。其中，amiR-AVl-3靶向ToLCV的AV1基因，amiR -AV1一l靶向AV1和AV2重疊基因。導(dǎo)入amiR-AVl-l的T2代轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)ToLCNDV的抗性達(dá)80%。amiRNA技術(shù)通過(guò)創(chuàng)造新的非天然miRNA，為植物病害治理提供了新的契機(jī)，然而由于miRNA的生成和作用機(jī)制尚未完全清楚，仍存在一些不確定因素，有待更多的實(shí)驗(yàn)研究。

4 展望

miRNA作為一種普遍存在于生物體內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控因子，不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還與響應(yīng)生物脅迫密切相關(guān)。番茄是研究植物與微生物百作的模式植物之一。從番茄中挖掘與生物脅迫相關(guān)的miRNA以及在植物病害治理上應(yīng)用amiRNA技術(shù)已經(jīng)取得了重大突破，這些成果對(duì)番茄抗病研究具有重要意義。結(jié)合基因工程技術(shù)把天然miRNA或miRNA導(dǎo)入不同品種的番茄中，不但能夠深入了解生物脅迫相關(guān)miRNA的分子作用機(jī)制，還可獲得抗病新種質(zhì)，經(jīng)過(guò)高效種植技術(shù)從而提高番茄的經(jīng)濟(jì)效益。同叫，番茄生物脅迫相關(guān)miRNA的挖掘也會(huì)對(duì)其他植物的相關(guān)研究起到積極的推動(dòng)作用。相信在不久的將來(lái)，隨著人們對(duì)miRNA及amiRNA的進(jìn)一步子解和掌握，將為植物病害防治提供一條全新的路線(xiàn)。