熱休克蛋白表位肽免疫對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響

孫云霄 張禮標(biāo) 王華倩 張宇 熊祺琰 曹榮月 吳潔

摘 要：利用BSP65 （heat shock protein 65，HSP65）中與炎癥性自身免疫性疾病相關(guān)的兩段功能表位EE14（176-189）、DL18 （215-232），通過(guò)戊二醛偶聯(lián)法與BSA （bovine serum albumin， BSA）制備成多肽-BSA偶聯(lián)蛋白，獲得可用于免疫高脂膳食動(dòng)物的蛋白。與PBS （phospllate buffer saline，PBS）組比較，多肽免疫組抗HSP65抗體滴度與總膽固醇（total cholesterol，TC）含量無(wú)明顯區(qū)別（P<0.05），抗自身肽的抗體在兩免疫組的結(jié)果不同，但兩組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積都顯著增加，兩免疫組斑塊面積與血管總面積百分比分別為39.61%與36.75%，為PBS組（斑塊面積占血管總面積百分比為10.35 %）的3.8倍和3.6倍，有顯著性差異（P<0.05） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSP65相關(guān)B細(xì)胞表位肽，皮下免疫能顯著促進(jìn)AS （atherosclerosis，AS）斑塊生成。 在后續(xù)研究中可利用以上表位，通過(guò)改變免疫方式，設(shè)計(jì)可用于抑制AS斑塊生成的免疫調(diào)節(jié)劑，進(jìn)一步考察HSP65功能性B細(xì)胞表位的免疫預(yù)防及治療效果。

關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化（AS）：熱休克蛋白（HSP）：免疫

中圖分類號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）06-0471-06

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis. AS）是慢性自身免疫性炎癥疾病，適應(yīng)性免疫和天然免疫反應(yīng)引起的炎癥反應(yīng)在AS發(fā)展的所有階段中起著關(guān)鍵作用。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）在進(jìn)化上被認(rèn)為是一類高度保守的蛋白，在AS發(fā)病過(guò)程中作為自身抗原起著重要的作用。人源的HSP60 （hHSP60）與結(jié)核分支桿菌來(lái)源的HSP65 （mHSP65）大概存在50%的同源性，高度同源，而原核微生物之間HSP同源性更是能達(dá)到97%，兩者具有相似的抗原表位，因此mHSP65能通過(guò)分子模擬產(chǎn)生抗人自身HSP60的免疫反應(yīng).誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞攻擊自身抗原，引起人自身免疫性反應(yīng)而促進(jìn)AS的發(fā)生。

抗原分子在免疫反應(yīng)過(guò)程中起主要作用的是T和B細(xì)胞表位。HSP65中有許多與AS相關(guān)的表位如36 -45、91-100、111 -120、160 -177、179 -190、215-232、433-450和507-516等，大部分是B細(xì)胞表位。通過(guò)對(duì)AS患者血清內(nèi)獲得抗體和健康人體內(nèi)獲得的抗體對(duì)mHSP65與hHSP60進(jìn)行抗原掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多抗原表位是hHSP60與mHSP65共有表位。其中HSP65（179-190）與HSP6525（215-232）就同為HSP65/60兩者共有表位。HSP65（179-190）為佐劑性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)重要表位，因?yàn)锳S與佐劑型關(guān)節(jié)炎同為炎癥性自身免疫疾病，研究選擇了與 HSP65（179-190）基本相同的HSP65（176-189） （EESNT-FGLQLELTE）（EE14）B細(xì)胞表位來(lái)進(jìn)行致AS研究：而HSP65（215-232）（DPYILLVSSKVSTVKDLL） （DL18）為動(dòng)脈粥樣硬化患者出現(xiàn)抗HSP65抗體頻率最高的幾個(gè)B細(xì)胞表位之一。選擇以上兩個(gè)B細(xì)胞表位，合成制備表位肽，通過(guò)皮下免疫高脂誘導(dǎo)的新西蘭大白兔研究其對(duì)AS的皮下免疫效果，進(jìn)一步研究HSP相關(guān)表位與AS之間的關(guān)系。前期研究利用HSP65中的T和B細(xì)胞表位構(gòu)建的多肽疫苗經(jīng)粘膜免疫后降低AS斑塊形成的效果并不理想，本研究單獨(dú)觀察HSP65上的B細(xì)胞表位皮下免疫后致AS結(jié)果，基于此結(jié)果，進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)出可通過(guò)粘膜免疫的抗AS斑塊形成的表位多肽疫苗，通過(guò)研究HSP重要功能表位與AS之問(wèn)的關(guān)系，為抗AS多肽抑制劑的設(shè)計(jì)提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

將EE14與DL18合成肽通過(guò)戊二醛溶液法分別與牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）偶聯(lián)制備成偶聯(lián)蛋白，以提高表位抗原肽的免疫原性，并與弗氏不完全佐劑制備成乳劑，塒高脂膳食誘導(dǎo)的患AS新西蘭大白兔進(jìn)行皮內(nèi)皮下聯(lián)合免疫，測(cè)定動(dòng)脈粥樣斑塊的大小，血清中總膽同醇含量變化及抗HSP65抗體產(chǎn)生情況及變化趨勢(shì)，研究HSP65功能表位肽在弗氏不完全佐劑條件下經(jīng)皮下免疫是否加重動(dòng)脈粥樣硬化病情。

1 材料和方法

1.1 試劑、融合蛋白與動(dòng)物

EE14和DL18由上吉爾牛化（上海）有限公司合成?？紤]單純合成的多肽免疫原性很低，所以研究中將多肽與BSA通過(guò)戊二醛偶聯(lián)成偶聯(lián)蛋白來(lái)加以免疫，以克服單純的合成多肽片段難以激發(fā)免疫反應(yīng)的不足。

膽同醇純度>99.9%（上海生工）；弗氏不完全佐劑（Freund's adjuvant incomplete， IFA） （Sigma.USA）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；總膽固醇（total choles-terol， TC）測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；其余為常規(guī)試劑，國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。

新西蘭大白兔購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，雄性，體重1.5—2.0 kg，置于一般室內(nèi)環(huán)境單籠飼養(yǎng)

1.2 方法

1.2.1 多肽與BSA偶聯(lián)

戊二醛作為一種雙功能偶聯(lián)劑，其兩個(gè)醛基通過(guò)結(jié)合賴氨酸殘基上的游離氨基，把不同抗原連接起來(lái)。合成表位肽EE14與BL18和BSA各5 mg溶解于PBS.混勻，邊攪拌邊向混合液緩慢滴加0.25% PBS稀釋的戊二醛溶液，放置于低溫條件下過(guò)夜反應(yīng)。第2 d觀察生成的偶聯(lián)物，若溶液變?yōu)榈S色，則逐滴加入l mol/L PBS稀釋的甘氨酸溶液，在低溫條件下終止此反應(yīng)30 min后，將偶聯(lián)液以1：20的比例對(duì)PBS透析，6h左右換透析液，隨后再更換3次透析液（每隔12 h一次）。冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.2.2 新西蘭大白兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立和免疫

新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組，分別為PBS、EE14及DL18免疫組。其中PBS組9只，其余兩組各8只。各組新西蘭大白兔飼喂高膽固醇食物，每只兔每天的膽同醇攝人量為0.5 g（飼料配方為0.5%的膽固醇，5%的油脂與94.5%的基礎(chǔ)飼料），前后高脂飼料飼喂共5個(gè)月左右，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)PBS組新兩蘭大白兔腹主動(dòng)脈中有明顯的粥樣斑塊生成。各組藥物均以滅菌PBS溶解，與IFA一起等量配制成0.2 mg/mL濃度，免疫劑量為每只200 μg，注射體積為每只1mL。皮內(nèi)皮下多點(diǎn)注射的方法免疫新西蘭大白兔，背部4點(diǎn)皮內(nèi)注射，頸部l點(diǎn)皮下注射，自造模開(kāi)始，免疫4次，前4個(gè)月每月免疫1次，第一次免疫在高脂喂養(yǎng)2周后。各組分別于免疫的第0、3、5、8、Il、14、18、22周耳緣靜脈取全血，靜置1 h左右，低溫條件下4 000 t/min進(jìn)行離心，取上清，放置冰箱-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 覓體征變化情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中肉眼觀察新西蘭大白兔的外觀、行為、活動(dòng)、攝食量、體重、糞便及眼、耳、皮膚等器官的情況，最后在解剖新西蘭人白兔取出主動(dòng)脈過(guò)程中觀察心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟器管的變化。1.2.4 抗HSP65、抗EE14與抗DL18抗體（lgG）的ELISA檢測(cè)

用不同的包被抗原包括純化的HSP65或EE14. DL18包被酶標(biāo)板，10μg/mL的抗原濃度溶于包被稀釋液，每孔加入100 μL，低溫條件下包被過(guò)夜：倒掉包被液，加2%BSA封閉液，低溫條件下封閉過(guò)夜；倒掉封閉液，加1：200稀釋的兔血清 1oo μL， 37℃進(jìn)行孵育l h左右；去血清，用PBST與水交替洗滌6次后，加入1：20 000倍稀釋的酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，孵育。倒去酶標(biāo)二抗，PBST與水交替洗滌；加100 μL底物液，37℃反應(yīng)45 min左右，加入H2S04終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm光密度值。

1.2.5 兔血清中總膽固醇含量檢測(cè)

利用榮盛牛物技術(shù)有限公司（上海）的TC檢測(cè)試劑盒，通過(guò)膽固醇氰化酶一過(guò)氧化物酶方法測(cè)定血清中的TC含量，利用可見(jiàn)分光光度儀于500 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值，計(jì)算肌固醇含量（mmol/L） 。

1.2.6 兔腹主動(dòng)脈粥樣病斑測(cè)定

新西蘭大白兔通過(guò)頸動(dòng)脈放血的方法處死，從主動(dòng)脈出心臟開(kāi)始至髂動(dòng)脈分義處分離出主動(dòng)脈，將血管外面的脂肪組織小心剔除，后沿背側(cè)順剪開(kāi)，用10%甲醛進(jìn)行固定，4 d后用0.2%蘇丹Ⅲ（SudanⅢ）乙醇溶液進(jìn)行染色半小時(shí)左右，70%乙醇溶液進(jìn)行洗滌完全，將染色后的血管內(nèi)表面通過(guò)掃描儀進(jìn)行掃描后，利用MarJlnfor7.0軟件統(tǒng)計(jì)斑塊而積與血管內(nèi)表皮的總面積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示。所有統(tǒng)計(jì)分析采用Student's t test，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 兔體征變化情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中肉眼觀察新西蘭大白兔的外觀、攝食量、體重、行為、活動(dòng)、糞便及眼、耳、皮膚等器官的情況均未見(jiàn)異常變化。體重變化正常.逐日增加。

此外，對(duì)處死后兔的肝、脾、肺、腎等臟器，進(jìn)上肉眼和顯微觀察，在外觀上這些臟器無(wú)明顯病變，無(wú)異常粘連物質(zhì)。

結(jié)果表明，2組多肽注射免疫組與PBS對(duì)照組相比，對(duì)新西蘭人門兔的生長(zhǎng)并無(wú)明顯影響，除主動(dòng)脈外其他的臟器無(wú)明顯異常。

2.2 抗HSP65、抗EE14與抗DL18抗體（IgG）的ELISA檢測(cè)

以HSP65蛋白為包被抗原。檢測(cè)PBD組、EE14、DL18免疫組血清中特異性抗HP65抗體的產(chǎn)生情況，檢測(cè)結(jié)果如下（圖1）。

在弗氏不完傘佐劑存在情況下，合成肽DLl8免疫組沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生姒的抗Hsp65抗體，與PBS相比，沒(méi)有明顯差異而合成肽EEl4在第一次免疫后的第3周抗Hsp65抗滴度與 PBS組相比有所升高，隨后在第5周以后卻低于PBS對(duì)照組，且與PBS組差異不大，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與PBS組未見(jiàn)有顯著差異（圖1）

以合成肽DL18蛋白為包被抗原，檢測(cè)PBS組，DLl8免疫組的血清中針對(duì)DL18合成肽抗體的的產(chǎn)生情況，檢測(cè)結(jié)果如下。在弗氏不完余佐劑存在的情況下，以合成肽DL18皮內(nèi)皮下免疫新西蘭大白兔，在第一次免疫后的第3周即可測(cè)得血清中抗DL18抗體的產(chǎn)生，并且與對(duì)照組相比差異顯著（P

以合成肽EE14蛋白為包被抗原，檢測(cè)PBS組.EEI4給藥組的血清中針對(duì)EE14合成肽抗體的產(chǎn)生情況，檢測(cè)結(jié)果如下。在弗氏不完全佐劑存在的情況下，合成肽EE14皮內(nèi)皮下免疫新西蘭大白兔，與PBS組相比，沒(méi)有誘導(dǎo)出針對(duì)抗EE14的抗體（圖3）。

2.3 免疫后兔血清TC的含量測(cè)定

利用上海榮盛生物技術(shù)有限公司的總膽同醇測(cè)定試劑盒，測(cè)得各組兔血清的總膽固醇含量見(jiàn)圖4。在弗氏不完全佐劑存在的條件下，EE14、DL18合成肽和PBS共同免疫新西蘭大白兔，從圖4可以看出，盡管后期（第22周最后一次取血測(cè)定）能影響血清中TC含量，但并無(wú)明顯的差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩組合成肽免疫組對(duì)新西蘭大白兔的血脂含量（TC）不會(huì)產(chǎn)明顯影響。從針對(duì)抗Hsp65抗體的產(chǎn)生情況看，與PBS組相比較兩組合成肽免疫組都未能誘導(dǎo)出高的抗Hsp65抗體.甚至還明顯低于PBS免疫組（圖1），這可能與其對(duì)TC含量不會(huì)產(chǎn)生影響有關(guān)。

2.4 新西蘭大白兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊測(cè)定結(jié)果

因膽固醇易被SudanⅢ染成紅色，而粥樣斑塊中富含膽固醇，因此經(jīng)染色后，斑塊部分則會(huì)與斑塊周圍正常血管部位區(qū)別開(kāi)。利用軟件對(duì)粥樣斑塊的面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PBS對(duì)照組粥樣斑塊面積為主動(dòng)脈血管總面積的10.35%（圖5）；合成肽EE14和DL18與弗氏不完全佐劑免疫組主動(dòng)脈粥樣斑塊面積分別占血管總面積的百分比分別為39.61和36.75%f圖6、7）。與PBS組比較，主動(dòng)脈硬化斑面積與血管總面積百分比分別約為PBS組的3.8倍和3.6倍，與PBS免疫組相比有顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8）。綜合以上結(jié)果，合成肽EE14與DL18在弗氏佐劑存在情況下經(jīng)皮下皮內(nèi)免疫新西蘭大白兔均能激發(fā)加強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊生成

3 討論

許多研究發(fā)現(xiàn)HSP65/60是致動(dòng)脈粥樣硬化因子，通過(guò)用從AS患者血清內(nèi)獲得抗體與健康人體獲得的抗體對(duì)mHSP65和hHSP60進(jìn)行抗原掃描，發(fā)現(xiàn)兩者具有許多共有表位。用從卡介苗得到的mHSP65通過(guò)皮下注射免疫高脂膳食誘導(dǎo)的新西蘭大白兔能誘發(fā)AS，用重組的mHSP65肌注免疫后也能觀察到可明顯加劇AS，然而，用HSP65經(jīng)鼻粘膜途徑免疫高脂高膽固醇膳食新西蘭大白兔，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌HSP65經(jīng)粘膜免疫不僅不會(huì)加劇AS，反而能有效防止AS的發(fā)生和發(fā)展。提示在HSP65中存在AS相關(guān)的功能性表位肽段，這種表位在皮下注射免疫時(shí)會(huì)誘發(fā)AS，但通過(guò)粘膜免疫卻能激發(fā)旁路抑制，起到預(yù)防AS的作用。通過(guò)研究人與微生物HSP60/65的共有表位及各自特有表位是否能誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，可為動(dòng)脈粥樣硬化的免疫治療找到精確靶點(diǎn)，也能利用分棟出的表位肽段發(fā)展抗動(dòng)脈粥樣硬化疫苗。前期研究中選擇了HSP65中的T和B細(xì)胞表位構(gòu)建多肽疫苗，經(jīng)粘膜免疫后降低AS斑塊形成的效果不明顯，原岡口JI能是免疫過(guò)程中存在T表位對(duì)B表位功能的掩蓋作用，因此本研究考慮利用直接合成B細(xì)胞表位后皮下注射免疫新西蘭大白兔，單獨(dú)觀察HSP65上的B細(xì)胞表位皮下免疫后是否能明顯增加AS斑塊生成，如果出現(xiàn)預(yù)期的結(jié)果，可利用這些B細(xì)胞表位，進(jìn)一步構(gòu)建設(shè)計(jì)出具有強(qiáng)的免疫原性的表位多肽，通過(guò)粘膜免疫方法進(jìn)行免疫，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究出有效的抗AS疫苗。選擇的EE14為佐劑性關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)重要表位，DL18為動(dòng)脈粥樣硬化患者出現(xiàn)抗HSP65抗體頻率最高的幾個(gè)B細(xì)胞表位之一，本研究中將表位與BSA偶聯(lián)制備成偶聯(lián)蛋白加以免疫以激發(fā)顯著的免疫反應(yīng)，結(jié)果表明兩表位確實(shí)能加劇AS粥樣硬化斑塊的生成。

有研究表明，HSP65抗體水平的提高與AS和冠心病及臨界高血壓有關(guān)，HSP65/60抗體在AS的初始階段通過(guò)自身免疫機(jī)制發(fā)揮作用?！氨砦粩U(kuò)展”是直接致病抗體缺乏情況下，抗原特異性B淋巴細(xì)胞促進(jìn)疾病發(fā)生的重要機(jī)制，B淋巴細(xì)胞能通過(guò)提高遞呈的效能和多樣性促進(jìn)疾病發(fā)展，在持續(xù)的免疫應(yīng)答過(guò)程中，免疫系統(tǒng)可對(duì)隱蔽抗原表位相繼發(fā)生免疫應(yīng)答，即個(gè)別表位免疫后能誘導(dǎo)出針對(duì)大分子的抗體。在弗氏不完全佐劑仔在下進(jìn)行免疫，以HSP65蛋白為包被抗原，DL18和EE14兩組都未檢測(cè)出有明顯的抗HSP65抗體的產(chǎn)生，可能是HSP65分子太大，上面包含了大量的T或B細(xì)胞，而我們的合成肽片段太小，上面的表位太少，而難以誘導(dǎo)出針對(duì)整個(gè)大分子的抗體，說(shuō)明單獨(dú)的小分子表位肽段免疫過(guò)程中未出現(xiàn)所謂的“表位擴(kuò)展”，即未擴(kuò)展到針對(duì)HSP65的其他表位的免疫反應(yīng)。兩組分別以DL18和EE14為包被抗原，結(jié)果顯示DL18免疫組在第一次免疫后的第3周即可測(cè)得血清中抗DL18抗體的產(chǎn)生，差異顯著，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

在血脂方面，EE14、DL18合成肽和PBS共同免疫新西蘭大白兔，兩組盡管后期能影響血清中TC含量，使之稍有升高，但并無(wú)明顯的差異，即兩組合成肽免疫組對(duì)新西蘭大白兔的血脂（TC）含量沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。從抗HSP65抗體的產(chǎn)生情況看，與PBS組相比較兩組合成肽免疫組都未能誘導(dǎo)出高的抗HSP65抗體，無(wú)明顯差別。結(jié)合項(xiàng)目前期研究結(jié)果，出現(xiàn)高的抗HSP65抗體組同時(shí)也伴隨高的血清TC含量，推測(cè)抗HSP65水平可能與對(duì)TC含量的影響有關(guān)。

從粥樣硬化斑塊占整個(gè)主動(dòng)脈血管的面積比上看，合成肽DL18和EE14兩免疫組都可明顯加重AS斑塊生成，其斑塊面積與主動(dòng)脈血管總面積百分比分別為36.75%與39.61%，約為PBS組的3.6倍和3.8倍，與PBS免疫組相比有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義fP<0.05），因此合成肽EE14與DL18在弗氏佐劑存在情況下經(jīng)皮下皮內(nèi)免疫新西蘭大白兔均能激發(fā)加強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊生成。和前人研究結(jié)果之HSP65及其相關(guān)表位皮下注射免疫能加重AS保持了一致，表明所選擇的表位在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)及增加AS斑塊形成過(guò)程中起著重要作用，但作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上研究結(jié)果，盡管從抗體生成角度和血脂水平還不能明確其加重AS斑塊形成的機(jī)制，但通過(guò)所選表位經(jīng)皮下免疫確實(shí)能誘發(fā)斑塊加劇生成的結(jié)果。結(jié)合前面提到在HSP65分子中存在AS相關(guān)的功能性表位肽段皮下注射免疫是誘發(fā)加重AS斑塊生成，可通過(guò)粘膜免疫卻能激發(fā)旁路抑制，起到預(yù)防AS的作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以考慮基于這些B細(xì)胞表位設(shè)計(jì)出通過(guò)粘膜免疫方式進(jìn)行免疫的抗AS疫苗，本課題也已在開(kāi)展此方面的工作。再結(jié)合粘膜免疫的結(jié)果進(jìn)一步研究這些表位的功能和免疫機(jī)制及進(jìn)行抗AS斑塊生成的免疫調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)研究。