海南木豆叢枝植原體質(zhì)粒全序列測定及分析

李玲婷等

摘 要 提取木豆葉片基因組總DNA，通過克隆，測序木豆叢枝植原體海南株系質(zhì)粒（pPPWB-Hn）的完整DNA序列，并使用生物信息學(xué)軟件對該質(zhì)粒全長序列進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示：pPPWB-Hn質(zhì)粒全長4 218 bp，含有4個(gè)開放閱讀框，分別編碼Rep、dnaG、threonine synthase和未知蛋白。其中，Rep是2次跨膜蛋白，dnaG是單次跨膜蛋白，Rep和dnaG均與質(zhì)粒自主復(fù)制有關(guān)。Rep和未知蛋白可能分布在細(xì)胞質(zhì)中，dnaG可能定位到細(xì)胞膜上或膜外，Threonine synthase可能定位到線粒體膜上或線粒體內(nèi)腔。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：pPPWB-Hn與植原體16SrⅡ組的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及pTBBcap（DQ119296）處在同一進(jìn)化分支。

關(guān)鍵詞 木豆叢枝植原體；質(zhì)粒；序列分析

中圖分類號 S432.42 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The complete nucleotide sequence of plasmid from pigeon pea witches-broom phytoplasma has been determined. The plasmid， pPPWB-Hn， was 4 218 bp in length and contained 4 putative ORFs. ORF1 encoded a replication protein（Rep）with two transmembrane domains. ORF2 encoded dnaG with a single transmembrane domain. ORF3 encoded threonine synthase， and ORF4 encodedan unknown function protein. Threonine synthase and unknownprotein are not transmembrane protein. The Rep and dnaG were relatively to autonomous replication of the plasmid. The Rep， dnaG， threonine synthas and unknownprotein were presumably to be localized to thecytoplasm， the membrane or cytoplasm， the mitochondrial membrane or mitochondrial cavity， and cytoplasmrespectively. The phylogenetic tree showed that the sequence was clustered in the same clade with pPNWB（AY270152）， pTBBperi（DQ119297）and pTBBcap（DQ119296）， which belonged to 16Sr IIgroup phytoplasma。

Key words Pigeon pea witches'-broom phytoplasma； Plasmid； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.026

木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]又名三葉豆、鴿豆、樹豆，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物[1-2]。在中國木豆主要種植在云南、廣西、海南等地，用于喂養(yǎng)家畜和家禽，枝條可作為柴薪，提取物可制成藥物[3-6]。木豆叢枝病是由植原體引起的一類世界性病害，防治困難，美國的佛羅里達(dá)洲，加勒比海地區(qū)、牙買加等地種植的木豆均受到該病的侵害[7-8]。中國學(xué)者1986年在海南儋縣發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)叢枝癥狀的木豆植株，通過電子顯微鏡觀察到植原體的存在，通過對木豆叢枝植原體16S rDNA和rp基因的分析，確定引起海南木豆叢枝的植原體屬于16S rⅡ組中的亞組ⅲ[9-10]。目前除臺灣、海南外，中國尚未見其它地區(qū)有關(guān)于木豆叢枝病的研究報(bào)道。

質(zhì)粒是一種可以自我復(fù)制的染色體外DNA分子，1988年首次在玉米叢縮病植原體中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒[11]，目前已在20多種植原體中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的存在，近年的研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)?？赡茉谥苍w進(jìn)化，種群多樣性，致病性等方面發(fā)揮重要作用，也與植物雙生病毒間存在一定的進(jìn)化關(guān)系，植原體質(zhì)粒研究已成為植原體致病性研究不可缺少的一部分[12-16]。本研究測定了木豆叢枝植原體的一個(gè)完整質(zhì)粒序列，并利用生物信息學(xué)分析對其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行預(yù)測，為進(jìn)一步研究該質(zhì)粒功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

木豆叢枝病樣品采自海南儋州，感病木豆植株明顯矮化，節(jié)間縮短，葉片變小，叢生，該病害由海南木豆叢枝植原體（Hainan pigeon pea witches'-broom， PPWB-Hn）引起[17]。

1.2 方法

1.2.1 木豆葉片基因組總DNA提取 采用天根生物工程有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)試劑盒操作說明提取木豆基因組DNA。

1.2.2 植原體質(zhì)粒的克隆 根據(jù)已發(fā)表的植原體16SrⅡ組質(zhì)粒Peanut witches'-broom phytoplasma plasmid pPNWB（登錄號：AY270152）和Tomato big bud phytoplasma plasmid pTBBcap（登錄號：DQ119296）序列同源性比對結(jié)果，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物M-11（5′-TGCGTCGTGGTCATCGTAGT-3′）/M-12（5′-GGGCG

ATAAGGTAATTCTGC-3′）。以表現(xiàn)叢枝癥狀的木豆葉片基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得植原體質(zhì)粒片段。

木豆叢枝植原體質(zhì)粒第1次PCR反應(yīng)采用TaKaRa Taq進(jìn)行。反應(yīng)體積25 μL，內(nèi)含DNA樣品1 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）5 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。第2次PCR反應(yīng)采用TaKaRa LA Taq進(jìn)行。反應(yīng)體積25 μL，內(nèi)含DNA樣品1 μL，10×LA PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）各1 μL，LA Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。第1次及第2次PCR產(chǎn)物均在1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳30 min，經(jīng)Goldview染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

PCR擴(kuò)增出的目的DNA片段由TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0純化回收后克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli Competent Cell DH5α，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，用PCR反應(yīng)檢測陽性克隆，序列測定委托上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 序列分析 序列裝配及特征簡析利用DNAman分析軟件，開放閱讀框預(yù)測采用NCBI網(wǎng)站的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），序列同源性比較分析采用NCBI網(wǎng)站的BLAST（Basic Local Alignment Search Tools）工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），串聯(lián)重復(fù)序列分析使用RepeatMasker程序（http：//www.repeatmasker.org/），跨膜區(qū)預(yù)測使用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/），亞細(xì)胞定位使用TargetP 程序預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析采用MEGA4.0.2，

2 結(jié)果與分析

2.1 pPPWB-Hn的克隆及分子特征

2.1.1 pPPWB-Hn的克隆 以表現(xiàn)叢枝癥狀的木豆葉片基因組DNA為模板，用引物M-11/M-12進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增獲得長度1 189 bp的片段pPPWB-Hn F1（圖1），根據(jù)pPPWB-Hn F1片段的序列設(shè)計(jì)反向PCR引物NM-1（5′-CCACTAAATAAGATGC

CTGAAA-3′）/NM-2（5′-GCCGTATTATGCGGTAGAT

T-3′）進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，獲得長度3 383 bp的片段pPPWB-Hn F2（圖2），將2條末端重疊的片段pPPWB-Hn F1和pPPWB-Hn F2使用DNAMAN6.0進(jìn)行序列拼接裝配，最終得到長度4 218 bp的環(huán)狀質(zhì)粒，命名為pPPWB-Hn（GenBank登錄號：KC935372）。

2.1.2 pPPWB-Hn的分子特征 pPPWB-Hn序列中A+T占72.85%，用NCBI網(wǎng)站BLAST進(jìn)行同源性分析可知pPPWB-Hn和pPNWB有97.82%的同源性，與pTBBcap有95%的同源性。串聯(lián)重復(fù)分析發(fā)現(xiàn)pPPWB-Hn含有2個(gè)簡單重復(fù)序列，第1個(gè)位于ORF3和ORF4之間的非編碼區(qū)（2 912～2 931 bp），長度為20 bp（AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA），第2個(gè)也位于ORF3和ORF4之間的非編碼區(qū)（3 618～3 637 bp），長度為20 bp（TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT）。

用NCBI的ORF Finder分析可知，質(zhì)粒一共有4個(gè)編碼大于100個(gè)氨基酸的開放閱讀框，其中ORF1、ORF2、ORF4的方向一致，ORF3與上述3個(gè)開放閱讀框方向相反（圖3）。將pPPWB-Hn編碼的4個(gè)蛋白氨基酸序列利用NCBI網(wǎng)站的protein BLAST進(jìn)行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比較，ORF1與pPNWB編碼的Rep蛋白同源性最高，達(dá)到95%，ORF2與pPNWB編碼的dnaG蛋白同源性最高，達(dá)到99%，ORF3與pPNWB編碼的蘇氨酸合成酶（Thr synthase）蛋白同源性最高，達(dá)到100%，ORF4與pPNWB編碼的一個(gè)未知蛋白同源性最高，達(dá)到88%（表1）。

2.2 pPPWB-Hn編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用TMpred程序?qū)π蛄芯幋a的4種蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測（http：//www.ch.embnet.org/），結(jié)果表明，ORF1編碼的Rep蛋白具有1個(gè)從膜外向膜內(nèi)的跨膜區(qū)（AA：249～273）和1個(gè)從膜內(nèi)向膜外的跨膜區(qū)（AA：334～353）；ORF2編碼的dnaG蛋白是個(gè)單次跨膜蛋白（AA：292～308），且N端位于膜外側(cè)；ORF3編碼的Threonine synthase和ORF4編碼的未知蛋白沒有跨膜區(qū)出現(xiàn)。

2.3 pPPWB-Hn編碼的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用TargetP 程序預(yù)測亞細(xì)胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/），見表2所示，4種蛋白都不含葉綠體定位信號，ORF1編碼的Rep和ORF4編碼的未知蛋白不含線粒體定位序列及信號肽序列，可能分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，ORF2編碼的dnaG含有信號肽序列，信號值為0.891，可能進(jìn)入分泌途徑定位到細(xì)胞膜上或膜外，ORF3編碼的Threonine synthase含有線粒體定位信號肽，信號值為0.764，可能定位到線粒體膜上或線粒體內(nèi)腔（表2）。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出：pPPWB-Hn與植原體16SrⅡ組的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及 pTBBcap（DQ119296）處在同一進(jìn)化分支（圖4）。

3 討論與結(jié)論

質(zhì)粒數(shù)目和大小在不同植原體中均不相同，已報(bào)道的最大植原體質(zhì)粒為葉蟬傳甜菜綠化植原體質(zhì)粒（pBLTVA-1），大小為10 785 bp，最小的質(zhì)粒為葉蟬傳甜菜綠化植原體質(zhì)粒（pBLTVA-2），大小為2 587 bp，大多數(shù)植原體質(zhì)粒序列長度在3 000 ～5 000 bp之間[16]。本研究測定了中國木豆叢枝植原體海南株系一個(gè)質(zhì)粒pPPWB-Hn的完整DNA序列，其大小為4 218 bp，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測該質(zhì)粒編碼4個(gè)蛋白，除包括所有植原體都含有的與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白外，還包括1個(gè)DNA 引物酶蛋白（dnaG）、1個(gè)蘇氨酸合成酶蛋白和1個(gè)未知功能的蛋白。對質(zhì)粒的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，pPPWB-Hn與16SrⅡ組植原體質(zhì)粒處在同一進(jìn)化分支，這與根據(jù)16S rDNA進(jìn)行的植原體分類結(jié)果一致[10]，這表明除了利用16S rDNA序列對植原體進(jìn)行分類外，質(zhì)粒序列也可作為植原體分類的依據(jù)。

目前，NCBI上已公布的植原體質(zhì)粒全序列有80多個(gè)，但多數(shù)是16SrⅠ組成員，植原體16SrⅡ組質(zhì)粒僅有pPNWB、pTBBcap和pTBBperi等公布。pPPWB-Hn與pPNWB相比：ORF1少84個(gè)堿基，全序列長度相近，ORF數(shù)量、編碼的蛋白功能和表達(dá)方向均相同；pPPWB-Hn與pTBBcap、pTBBperi相比差異較大：pTBBcap僅3個(gè)ORF，ORF的位置和大小差別較大，pPNWB質(zhì)粒Rep基因的大小差不多是pTBBcap和pTBBper的2倍，這可能和寄主植物、介體昆蟲及地理生態(tài)環(huán)境有關(guān)。關(guān)于木豆叢枝植原體體內(nèi)是否還存在其它質(zhì)粒以及植原體質(zhì)粒在病原與寄主植物互作中的作用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Ahlawat I P S， Gangaiah B， Singh I P， et al. Pigeon pea（Cajanus cajan）research in India-an overview[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences， 2005， 75： 309-320.

[2] 鄭作杰. 中國食用豆類學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1997： 306-327.

[3] 王 鵬， 任順成， 王國良. 常見食用豆類的營養(yǎng)特點(diǎn)及功能特性[J]. 食品研究與開發(fā)， 2009， 30（12）： 171-174.

[4] 王彩云. 豆類的營養(yǎng)價(jià)值和加工技術(shù)[J]. 西部糧油科技， 2001， 26（4）： 33-34.

[5] 李正紅， 周朝鴻， 谷 勇. 中國木豆研究利用現(xiàn)狀及開發(fā)前景[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2001， 14（6）： 674-681.

[6] 呂?；?袁 杰， 李正紅. 木豆籽實(shí)飼喂肉豬研究[J]. 飼料工業(yè)， 1995， 16（7）： 29-31.

[7] Hirumi H， Maramorosch K， Hichez E. Rhabdovirus andmycoplasmalike organisms： natural dual infection of Cajanus cajan[J]. Phytopathology， 1973， 63： 202

[8] Maramorosch K， Hirumi H， Kimura M， et al. Diseases of Cajanuscajan in the Caribbeanarea： anelectron microscope study[J]. FAO Plant Protection Bulletin， 1974， 22： 32-36.

[9] 陳作義， 沈菊英， 彭寶珍， 等. 五種豆科牧草叢枝病病原電鏡觀察[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 1986， 2（2）： 49-56.

[10]車海彥， 羅大全， 符瑞益. 海南省木豆叢枝病植原體的分子檢測及鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào). 2010， 40（2）： 113-121.

[11] Davis M J， Tsai J H， Cox R L， et al. Cloning of chromosomal and extrachromosomal DNA of the mycoplasmalike organism that causes maize bushy stunt disease[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions. 1988， 1： 295-302.

[12] Panopoulos N J， Peet R C. The molecular genetics of plant pathogenic bacteria and their plasmids[J]. Annual Review of Phytopathology. 1985， 23： 381-419.

[13] Vivian A， Murillo J， Jackson R W. The roles of plasmids in phytopathogenic bacteria： mobile arsenals[J]. Microbiology. 2001， 147： 763-780.

[14] Toruno T Y， Musi M S， Simi S， et al. Phytoplasma PMU1 exists as linear chromosomal and circular extrachromosomal elements and has enhanced expression in insect vectors compared with plant hosts[J]. Molecular Microbiology. 2010， 77： 1 406-1 415.

[15] Nishigawa H， Oshima K， Kakizawa S， et al. Evidence of intermolecular recombination between extrachromosomal DNAs in phytoplasma： a trigger for the biological diversity of phytoplasma？[J]. Microbiology， 2002， 148： 1 389-1 396.

[16] Lin C L， Zhou T， Li H F， et al. Molecular characterisation of two plasmids from paulowniawitches'-broom phytoplasma and detection of a plasmid-encodedprotein in infected plants[J]. European Journal of Plant Pathology， 2009， 123（3）： 321-330.

[17]車海彥， 羅大全， 符瑞益， 等. 海南省木豆叢枝病植原體的分子檢測及鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2010， 40（2）： 113-121.