三明野生蕉Whirly轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其在低溫脅迫下的定量表達(dá)分析

楊洋等

摘 要 以三明野生蕉葉片為材料，通過克隆獲得Whirly基因的ORF，并研究Whirly基因在不同溫度處理下的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：采用PT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到三明野生蕉Whirly基因，其在GenBank的登錄號(hào)為KC127691。Whirly的開放閱讀框?yàn)?38 bp，編碼245個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，Whirly蛋白屬于親水蛋白，不具有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該基因?qū)儆谥参颳hirly轉(zhuǎn)錄因子基因家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，Whirly轉(zhuǎn)錄因子在不同低溫脅迫下表達(dá)水平有較大差異，隨著溫度的降低，相對(duì)表達(dá)量呈“M”型變化模式，在20 ℃和4 ℃時(shí)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)合前人研究結(jié)果可知，三明野生蕉Whirly轉(zhuǎn)錄因子可能參與了包括抗寒等多個(gè)抗逆途徑的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 三明野生蕉；Whirly；基因克??；生物信息學(xué)；熒光定量PCR

中圖分類號(hào) Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression Under Low Temperature Conditions

of Whirly Transcription Factor in a Wild Banana

Accession（Musa spp.）from Sanming City

YANG Yang，LAI Gongti，LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China

Abstract In the paper， the open reading frame（ORF）of Whirly gene was cloned from a Sanming wild banana accession（Musa spp.）. The expression level of Whirly was studied under different temperature conditions. Whirly of Sanming wild banana was cloned by RT-PCR and the accession number was KC127691 in GenBank. Whirly contains a 755-nucleotides-long open reading frame（ORF），encoding a polypeptide of 245 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein was hydrophilic and without signal peptide. Whirly belongs to plant whirly transcription factors. The secondary structure was made of the alpha helix，beta sheet and coil. Real-time quantitative PCR results indicated that the expression level of Whirly transcription factor is quite different under different low temperature stress. With the temperature decreasing，the relative quantitative expression patten presented as “M”-type. The expression of Whirly peaked at the treatment of 20 ℃，and maintained a high levels at 4 ℃. Combining with previous studies，we predicted that whirly transcription factors may play an important role in many kinds of resistance response including cold-resistance.

Key words Sanming wild banana；Whirly；Gene cloning；Bioinformatics；QPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.015

芭蕉科（Musaceac）芭蕉屬（Musa）的香蕉（Musa spp.）是多年生大型草本單子葉植物，其產(chǎn)量?jī)H次于柑桔類水果，在世界水果生產(chǎn)中占有十分重要的地位[1]。中國香蕉在華南地區(qū)種植廣泛，其生長對(duì)溫度要求較高， 寒害嚴(yán)重影響香蕉的生長，使其產(chǎn)量大大降低[2]。福建省野生香蕉種質(zhì)資源幾乎覆蓋所有地市，對(duì)三明、福州[3-5]等地的野生蕉研究已有詳細(xì)報(bào)道。其中三明野生蕉耐寒性比較強(qiáng)，能夠耐-5 ℃以下的低溫[6]，可從中分離抗性目的基因資源，從而用于香蕉的抗性基因工程育種[7]。

Whirly（WHY）屬于轉(zhuǎn)錄因子，Desveaux等[8]從土豆中分離出來的核轉(zhuǎn)錄因子PBF-2（PR-10a binding factor2），是第一個(gè)Whirly家族成員。隨后Krause等[9]、Marechal等[10]又在擬南芥、土豆中發(fā)現(xiàn)其他成員，但目前尚未有香蕉Whirly克隆的相關(guān)報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，Whirly能與DNA以單鏈形式結(jié)合并調(diào)控抗性基因的表達(dá)，Whirly蛋白可與ERE元件[8，11]、端粒重復(fù)序列結(jié)合[12]，Xiong等[13]亦發(fā)現(xiàn)Whirly蛋白可與擬南芥AtKP1的上游元件結(jié)合。Despres等[14]發(fā)現(xiàn)StWhy1能特異地與ERE元件結(jié)合并誘導(dǎo)PR-10a基因的表達(dá)，而PR（pathogenesis-related protein）基因是可以被病原入侵激活表達(dá)的基因[15-16]，Whirly的抗病響應(yīng)亦可是水楊酸-依賴的抗病反應(yīng)[11]，RNA干擾技術(shù)可使水稻OsWhirly基因沉默并導(dǎo)致超敏反應(yīng)（Hypersensitiveresponse，HR）增強(qiáng)[17]。Whirly轉(zhuǎn)錄因子參與多個(gè)抗逆途徑，在抗病、抗衰老等多種生物抗性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)Whirly蛋白不僅在防御進(jìn)程中發(fā)揮作用，在葉綠體和細(xì)胞核中也能起到一定的作用[18]。所以，研究Whirly轉(zhuǎn)錄因子具有重要的意義。三明野生蕉抗性較強(qiáng)，從三明野生蕉中分離Whirly基因?qū)ο憬兜目剐杂N意義重大。本研究是在香蕉基因組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步克隆獲得三明野生香蕉（Musa spp.）Whirly基因，采用生物信息學(xué)和熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行初步的功能分析，深入研究Whirly轉(zhuǎn)錄因子在香蕉對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

三明野生蕉試管苗由本研究所提供，常溫下培養(yǎng)三明野生蕉試管苗，將從中所提取的RNA經(jīng)相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄后用于Whirly基因克??；試管苗分別經(jīng)28、20、13、4、0 ℃處理36 h后，提取總RNA進(jìn)行cDNA合成，用于熒光定量PCR（qPCR）分析，其中28 ℃處理為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 三明野生蕉試管苗總RNA提取和cDNA合成 三明野生蕉葉片總RNA的提取按照北京天恩澤基因有限公司的柱式植物RNA out 2.0（Column Plant RNAout 2.0）試劑盒說明書進(jìn)行。采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量?jī)x對(duì)所提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)。以提取的RNA為模板，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fementas）試劑盒，按照操作說明進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆 參照小果野生蕉基因組（http：//banana-genome.cirad.fr/）已知Whirly序列，以三明野生香蕉葉片第一鏈cDNA為模板，利用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計(jì)的上下游引物分別為Whirly-F1（CCTGCAACGATGAGAAG

AACCT）和Whirly-R1（GCTCTGATTTACCTTCCCCA

CT），用于克隆三明野生蕉Whirly基因的開放閱讀框（ORF）。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割取目的片段進(jìn)行回收，連接于pMD 18-T載體上，最后委托鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 三明野生蕉Whirly基因生物信息學(xué)分析 采用NCBI在線BLAST比對(duì)基因cDNA序列及其推導(dǎo)的蛋白序列同源性。應(yīng)用在線蛋白分析軟件ExPASy ProtParam、ProtScale、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NCBI-ProteinTools的CDD及在線PSIPRED對(duì)所獲基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 低溫脅迫下三明野生蕉Whirly定量表達(dá)分析 三明野生蕉在低溫脅迫下的定量表達(dá)分析按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒的步驟，先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成定量所需的cDNA。分別以28、20、13、4、0 ℃處理過的三明野生蕉試管苗cDNA為模板，采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量表達(dá)分析。用于Whirly定量表達(dá)分析的上下游引物分別為Whirly-F2（5′-GCTTCCTCTCATGCAGCTCT-3′）和Whirly-R2（5′-TGGTGACACTGACAAGGCAG-3′）。PCR反應(yīng)體系按照操作說明進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用相對(duì)定量法[19]，以18S rRNA為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物為18S rRNA-F（CCTGAGAAACGGCTACCACAT）

和18S rRNA-R（CACCAGACTTGCCCTCCA），對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆

以三明野生香蕉cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得700 bp左右的亮帶，與設(shè)計(jì)的目的片段大小一致。經(jīng)膠回收、純化，以pMD l8-T為載體對(duì)回收片段進(jìn)行TA克隆。取陽性克隆測(cè)序，測(cè)序獲得755 bp片段，包含上下游引物序列。經(jīng)序列比對(duì)分析可知，該片段與香蕉基因組Whirly及已登錄GenBank的其他植物Whirly基因同源性較高，可認(rèn)為是野生香蕉Whirly基因?？寺～@得三明野生蕉Whirly基因ORF為738 bp，編碼245個(gè)氨基酸（圖1），其在GenBank中的登錄號(hào)為KC127691。

2.2 三明野生蕉Whirly蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域分析

在線軟件分析結(jié)果如下，Whirly蛋白分子量為27 012.7 u，理論等電點(diǎn)為9.68，屬于堿性蛋白，預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為58.85，脂肪系數(shù)為74.37，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.347，表明它是一個(gè)親水蛋白，經(jīng)ProtScale預(yù)測(cè)的結(jié)果與上述結(jié)果一致。利用NCBI-Protein Tools的CDD在線軟件分析三明野生蕉Whirly的保守結(jié)構(gòu)域（圖2），由預(yù)測(cè)結(jié)果可知Whirly基因?qū)儆谥参颳hirly轉(zhuǎn)錄因子。

2.3 三明野生蕉Whirly蛋白質(zhì)信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

用SignaIP4.1 Server對(duì)三明野生蕉Whirly進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，其C、Y、S 值均小于0.5，由此預(yù)測(cè)三明野生蕉不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于線粒體基質(zhì)的可能性最大，還有部分位于線粒體內(nèi)膜、線粒體膜間隙及線粒體外膜。這與SignalP 4.0程序?qū)ζ溥M(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。因此可以推測(cè)該蛋白是在細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)行使其功能。

2.4 三明野生蕉Whirly蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

對(duì)三明野生蕉Whirly蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)表明，Whirly蛋白的結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成。無規(guī)則卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。用SWISS-MODEL在線工具對(duì)野生蕉試管苗Whirly氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圖3顯示了三明野生蕉Whirly蛋白是由α螺旋、β折疊片、β轉(zhuǎn)角等成分組成的三維結(jié)構(gòu)。

2.5 三明野生蕉Whirly與其他植物Whirly蛋白的同源性和分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

將Whirly氨基酸序列進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與短柄草Why2、玉米Why2、水稻W(wǎng)hy2、高粱Why2、擬南芥Why2、蘋果Why、馬鈴薯Why2、葡萄Why2、可可Why2等的相似性較高，分別為56%、54%、53%、52%、46%、45%、45%、43%、42%。采用MEGA5.0軟件構(gòu)建三明野生蕉Whirly的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)三明野生蕉Whirly與單子葉禾本科植物的高粱、玉米、水稻和短柄草Whirly2的親緣關(guān)系比較近，而與雙子葉十字花科的擬南芥等植物的Whirly1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 Whirly基因在低溫脅迫下的定量表達(dá)分析

待三明野生蕉Whirly和內(nèi)參基因qPCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析。結(jié)果表明，Whirly引物和18SrRNA引物特異性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合試驗(yàn)要求。Whirly基因在不同溫度下的轉(zhuǎn)錄水平見圖5，三明野生香蕉相對(duì)表達(dá)量呈“M”型變化模式，以28 ℃處理為對(duì)照，當(dāng)溫度下降到20 ℃處理36 h時(shí)，Whirly基因表達(dá)量上調(diào)至對(duì)照組的8.16倍，達(dá)到峰值；當(dāng)處理溫度為13 ℃時(shí)，Whirly基因表達(dá)量為對(duì)照的3.13倍；當(dāng)處理溫度為4 ℃時(shí)，Whirly基因的表達(dá)量再次上升，維持在較高的水平，為對(duì)照的5.62倍；當(dāng)溫度為0 ℃時(shí)，Whirly基因的表達(dá)量下降至對(duì)照的4.52倍。綜上可知，當(dāng)溫度為20 ℃和4 ℃時(shí)，Whirly具有2次轉(zhuǎn)錄高峰，因此Whirly轉(zhuǎn)錄因子在這2次高峰中可能參與了不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。

3 討論與結(jié)論

3.1 三明野生蕉Whirly蛋白結(jié)構(gòu)的特異性

Whirly蛋白是植物特有的高度保守的家族蛋白。本研究對(duì)三明野生蕉Whirly蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Whirly蛋白不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白，而有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的3個(gè)Whirly蛋白都有葉綠體或線粒體信號(hào)肽[20]，因此，三明野生蕉Whirly蛋白具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于線粒體基質(zhì)的可能性最大，還有部分位于線粒體內(nèi)膜、線粒體膜間隙及線粒體外膜，這與孔凡英等[21]預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致，在質(zhì)體內(nèi)含量較豐富的Whirly蛋白屬于堿性蛋白，其中Ser、Leu、Pro所占比重較大。二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Whirly蛋白表面有一個(gè)中心空穴并形成帶電的內(nèi)腔，與已有研究相符。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，Whirly蛋白與單子葉禾本科植物的親緣關(guān)系比較近，因此三明野生蕉Whirly蛋白具有與其他單子葉禾本科植物相似的生物學(xué)功能。

3.2 三明野生蕉Whirly可能參與多個(gè)抗逆途徑

研究表明，Whirly參與多個(gè)抗逆途徑，在多種生物抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用Despres等[14]發(fā)現(xiàn)StWhy1具有誘導(dǎo)PR-10a基因表達(dá)的作用，而PR基因是可以被病原入侵激活表達(dá)的基因[15-16]。Desveaux等[11]發(fā)現(xiàn)AtWhy1在與水楊酸反應(yīng)時(shí)會(huì)被激活并參與水楊酸-依賴的抗病反應(yīng)，AtWhy1單鏈結(jié)合蛋白表達(dá)受水楊酸分子影響[22-23]。目前發(fā)現(xiàn)的抗病相關(guān)的Whirly基因家族成員有ssi1、ssi2、cpr5、cpr6和hrl1[24-27]。由此可見，Whirly參與了植物抗病響應(yīng)途徑。Krause[9]等發(fā)現(xiàn)在大麥嫩葉中，Whirly1蛋白定位在質(zhì)體，但在衰老葉片中則定位在核內(nèi)，而Wingler[28] 研究發(fā)現(xiàn)，AtWhy2基因的敲除突變體能夠延遲衰老，表明Whirly轉(zhuǎn)錄因子在衰老調(diào)控中也起重要作用。本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和定量表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Whirly在不同溫度處理下出現(xiàn)2次表達(dá)高峰，分別是20 ℃和4 ℃，可見Whirly基因參與了三明野生蕉的低溫響應(yīng)，在抗寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合前人的研究結(jié)果推測(cè)，Whirly可能參與了包括抗寒在內(nèi)的多種抗逆途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，因此研究Whirly轉(zhuǎn)錄因子有著廣泛而深遠(yuǎn)的意義。

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責(zé)任編輯：林海妹