LC—MS/MS法測定人血漿中鹽酸馬尼地平及藥動學研究

李杰　邵鳳　許楊　陶春蕾　周燕　宋欣

摘 要 建立人血漿中鹽酸馬尼地平濃度測定的LC/MS/MS法，進行人體藥動學研究。方法： 通過24名健康志愿者口服受試制劑，采用單次空腹（20 mg（20 mg/片））和高脂餐后（20 mg（20 mg/片））兩周期雙交叉試驗及單次空腹10 mg（10 mg/片）和連續(xù)多次給藥10 mg（10 mg/片）試驗設計，測定人血漿中鹽酸馬尼地平的濃度。結果： 主要藥動學參數(shù)分別為：單次空腹口服10 mg，20 mg鹽酸馬尼地平后：Cmax3.52？.023 ng·mL-1，Tmax1.264？.372 h，AUC0-36h13.399？.451 ng/ml·h； Cmax5.59？.863 ng·mL-1，Tmax1.417？.359h， AUC0-36h23.697？0.179 ng/ml·h；單次餐后口服20 mg鹽酸馬尼地平后：Cmax9.307？.288 ng·mL-1， Tmax2.292？.782h， AUC0-36h39.674？.362 ng/ml·h；連續(xù)多次給藥10 mg鹽酸馬尼地平后Cmax3.454？.316 ng·mL-1，Tmax1.288？.38 h， AUC0-36h16.427？.554 ng/ml·h。結論： 本方法靈敏度高，結果準確，鹽酸馬尼地平在大部分人體內的過程符合二室開放模型，從而指導臨床合理用藥。

關鍵詞 鹽酸馬尼地平 藥代動力學 LC-MS/MS

中圖分類號：R9 文獻標識碼：A

鹽酸馬尼地平（Hydrochloride Manidipine）是新一代二氫吡啶類鈣離子雙通道拮抗劑[1]，具有高度的血管選擇性，對心臟作用很小。因此是一種強效、長效并能穩(wěn)定降低血壓藥物。但由于鹽酸馬尼地平給藥量小且性質不穩(wěn)定，所以常規(guī)的方法[2]不能滿足其在人體藥代動力學的研究要求。本實驗建立LC/MS/MS法，以地西泮為內標，能夠更有效的測定人體血漿中鹽酸馬尼地平的藥代動力學參數(shù)，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀；API 3000型質譜儀（AB公司）；CTC ANALYTIC型自動進樣器； GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機、TDL82-2B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金成國勝實驗儀器廠）；BF-2000氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-9140MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；工作站：Analyst 1.5等。甲醇、乙腈均為色譜純 （德國默克集團公司）；乙酸銨、乙酸均為分析純（天津市光復精細化工研究所）；乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉均為分析純（上海蘇懿化學試劑有限公司）；娃哈哈水（杭州哇哈哈集團有限公司）。

1.2 試驗藥物

鹽酸馬尼地平片Ⅰ，規(guī)格：10mg/片，批號：130304，有效期：36個月；鹽酸馬尼地平片Ⅱ，規(guī)格：20mg/片，批號：130305，有效期：36個月，由濟南利民制藥有限責任公司生產提供。鹽酸馬尼地平對照品，批號：110307，含量為：99.7%，由濟南利民制藥有限責任公司提供。地西泮對照品，批號：171225-200903，含量為：99.9%，購買自中國食品藥品檢驗所。

1.3藥代動力學試驗設計

1.3.1倫理學

根據(jù)赫爾辛基宣言、國際協(xié)調會議（ICH）的GCP原則、中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布的GCP原則和中華人民共和國藥品管理法。在試驗開始之前，研究人員向志愿受試者詳細說明了試驗藥物的性質，試驗的目的、方法，試驗的風險和自愿參加的原則，并獲得所有志愿受試者的知情同意書。

1.3.2試驗對象

試驗入選受試者體重45-72kg，平均體重55.71？.82kg；年齡20-25歲，平均年齡23.00？.25歲；男性受試者體重52-72kg，平均體重61.58？.99kg，年齡20-25歲，平均年齡23？.48歲；女性受試者體重45-58kg，平均體重49.83？.06kg，年齡21-24歲，平均年齡23？.04歲；男女體重指數(shù)均值19-24之間。

1.3.3試驗設計

單次給藥及食物影響試驗：采用單次空腹給藥和高脂餐后兩周期雙交叉試驗設計（交叉的目的是消除個體差異），將12名健康受試者（6男、6女）隨機分配至2 組，每位受試者第一周期分別空腹服用1片受試制劑鹽酸馬尼地平片Ⅱ（20mg/片）或高脂餐后服用1片受試制劑鹽酸馬尼地平片Ⅱ（20mg/片），按單劑給藥。試驗周期之間的清洗間隔為1周（清洗的目的是：藥物一般經過5-7個半衰期消除，清洗1星期是確保消除每個給藥周期的藥物體內蓄積）。單次給藥以及連續(xù)給藥試驗設計：招募12 名健康受試者，男女各半，受試者于試驗前 10 小時入住 I 期臨床監(jiān)護病房，每位受試者首先分別空腹單次口服1 片受試制劑鹽酸馬尼地平片Ⅰ（10mg/ 片），給藥兩天后按照下面采血點進行采血分析（即為單次空腹口服10mg/ 片），同一批受試者在單次空腹口服試驗制劑（10mg/ 片）后第 3 日晨每位受試者分別空腹口服試驗用1 片鹽酸馬尼地平片Ⅰ（10mg/ 片，1 片/ 次，1 次/ 日），連續(xù)在每天早上同一時間空腹服藥7 天，在第 6 、7、8 天每日服藥前采血一次（測定谷濃度），并于第 9 日給藥前經前臂靜脈留置針穿刺術，采集同一時間谷濃度血樣后服藥，且服藥后血樣采集均與單次給藥試驗時間點相同。

1.3.4生物樣品采集

單次給藥及食物影響交叉試驗采血點設計：于給藥前0h 及給藥后0.33（20min） 、0.67（40min） 、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 、12.0 、24.0 和36h 采集靜脈血，每一階段總計采集15 個點。服藥前1 小時內采集藥前血樣（0h）。連續(xù)給藥采血點設計要求與連續(xù)給藥試驗設計要求一樣，也是每個階段采集15個點。

1.3.5 血液樣品的處理及保存

每個血樣都應放置于預先標記好的肝素化試管中于3500 rpm離心5 分鐘，分離出的血漿在低于-20 ℃冷凍保存。從運輸?shù)綐悠繁环治鰰r都應在低于- 20 ℃保存。

1.3.6飲食要求

志愿受試者按照事先規(guī)定的時間進行飲水，服藥和進食；餐后試驗，從開始進高脂餐計時 30min 后服藥； 志愿受試者在試驗期間，至少從服藥前48h到最后一次采血前，禁服任何含酒精和黃嘌呤的食品和飲料。

1.3.7安全性評價

試驗后進行全面體格檢查（其中包括心電圖、血常規(guī)、尿常規(guī)、腎功能、肝功能等），各志愿者檢查結果未見異常，有個別生化檢查指標超出正常值范圍，經判斷無臨床意義。連續(xù)多次給藥試驗過程中入選號為13號受試者因個人原因退出試驗，剩余23例受試者全部完成試驗。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.1.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對血藥濃度時間數(shù)據(jù)進行處理，計算有關的藥代動力學參數(shù)。其中，達峰時間（Tmax）及峰濃度（Cmax）為實測值，藥-時曲線下面積（AUC）采用梯形法計算。半衰期（t l/ 2）按末端相血藥濃度對數(shù)值和時間進行線性回歸，求得斜率（Ke） 法計算。藥動學參數(shù)顯著性差異比較采用SPSS19.0軟件。

1.4 樣本測定及方法學考察

1.4.1 血漿樣品處理

精密量取200%eL血漿，精密加入20%eL內標地西泮對照溶液（100ng/mL），渦旋30s，加入100%eL氫氧化鈉（1mol/L）渦旋1min，加入4mL提取劑（正己烷：乙酸乙酯=2：1）震蕩渦旋3min，3000rpm離心10min ，取上清3.2mL，40℃氮氣吹干后，加入400%eL甲醇復溶，渦旋1min再取出置于1.5mL離心管中，12000rpm離心10min，取上清液20%eL進樣分析。

1.4.2 色譜、質譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX RX-C8 4.6？50 mm，5%em（Agilent）；流動相： 5mM乙酸銨（含0.1%乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，流速：0.6 mL/min；柱溫：40℃；樣品盤溫度：4℃；進樣量：20%eL。質譜條件：離子源：ESI；離子檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子極性：正離子；噴霧電壓（Ionspray Voltage）：5500V；溫度（Temperature）：550℃；霧化氣（NEB）：12psi；氣簾氣（CUR）：12psi；碰撞誘導解離（CAD）：10psi；用于定量的離子分別為馬尼地平[M+H]+m/z：611.5/166.7，錐孔電壓（DP）：30V，碰撞能（CE）：30V；內標地西泮[M+H]+m/z：285.1/154.0，DP：30，CE：30；掃描時間為0.15s。

1.4.3 血清中馬尼地平標準曲線

取馬尼地平儲備液，加空白血漿，按逐級稀釋的方法依次配制成相當于馬尼地平血漿濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、5、10、15 ng·mL-1的樣品，按“血漿樣品處理” 項下依法操作，進樣20 %eL。得到 y=0.184x-0.0018，r=0.9974，根據(jù)標準曲線，馬尼地平的線性范圍為0.1 ng·mL-1～15 ng·mL-1，定量下限為0.1 ng·mL-1（S/N>10）。

1.4.4 精密度和準確度試驗

取空白血漿，按“血漿中馬尼地平標準曲線和定量下限”項下的方法配制馬尼地平低、中、高三個濃度（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的質量控制（QC）樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定三天，根據(jù)當日的標準曲線，計算QC樣品的測得濃度。根據(jù)QC樣品結果計算本法的精密度，結果低、中、高濃度第一天日內的RSD分別為5.318%、3.290%、1.001%、第二天日內的RSD分別為6.959%、2.177%、3.641%，第三天日內的RSD分別為13.456%、3.998%、4.210%，低、中、高濃度日間的RSD分別為10.328%、5.461%、5.498%。結果表明，日內、日間相對標準差（RSD%）<15%。

1.4.5 回收率和基質效應的測定

分別精密加入馬尼地平濃度為（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高對照液各20%eL，40℃氮氣吹干，加入空白血漿200%eL，配制成馬尼地平血藥濃度為（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的低、中、高三個濃度的質量控制（QC）血漿樣品，按“血漿樣品處理方法” 項下自“精密加入20%eL內標地西泮對照溶液（100 ng·mL-1）”依法操作，得到馬尼地平和內標地西泮的峰面積值AMAN和ADIA；精密量取200%eL空白血漿，加入100%eL氫氧化鈉（1mol·L-1），渦旋1min后，加入4mL提取劑（正己烷：乙酸乙酯=2：1），震蕩渦旋3min，3000rpm離心10min，取上清液3.2mL于試管中，分別精密加入馬尼地平濃度為（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高對照液和內標地西泮對照溶液（100 ng·mL-1）各20%eL于試管中混勻，40℃氮氣吹干后，加入400%eL甲醇復溶，渦旋1min后，取出置于1.5mL離心管中12000rpm離心5min后，取上清液20%eL進樣分析。得到馬尼地平和內標地西泮的峰面積值BMAN和BDIA；分別精密量取馬尼地平濃度為（2.5，25和120 ng·mL-1）的低、中、高對照液和內標地西泮對照溶液（100 ng·mL-1）各20%eL于試管中，40℃氮氣吹干，加入360%eL甲醇混勻后，取上清液20%eL進樣分析，得到馬尼地平和內標地西泮的峰面積值CMAN和CDIA；按下式計算：提取回收率（%）=A/B？00%，基質效應（%）=B/C？00%，結果，馬尼地平的提取回收率為77.54%～83.80%，內標地西泮的平均提取回收率為78.82%。馬尼地平的基質效應范圍為75.83%～76.70%，內標地西泮的平均基質效應為78.66%。

1.4.6 穩(wěn)定性實驗

取低、中、高三個濃度（0.25，2.5和12 ng·mL-1）的血漿樣品按不同要求操作；分別考察血漿樣品按“血漿樣品處理”項下操作后，待測樣品室溫放置8h，10h，20h穩(wěn)定性（目的：在不同時間間隔取樣，進行分析測定，測定結果與0h測定值進行比較穩(wěn)定性）及血漿樣品在-20℃冰箱中反復凍融三次和冷凍條件下放置29天的穩(wěn)定性，結果見表1。結果顯示馬尼地平按“血漿樣品處理”項下操作室溫放置20h，-20℃冰箱中反復凍融三次及長期冷凍29天，穩(wěn)定性較好。

2結果

2.1 血藥濃度-時間曲線

12名志愿者空腹口服10mg、20mg和餐后口服20mg鹽酸馬尼地平片后，其馬尼地平的平均血藥濃度C（ng·mL-1）-時間t（h）如圖1-圖4；11名志愿者連續(xù)多次給藥7天鹽酸馬尼地平片（10mg/片），其馬尼地平的血藥濃度C（ng·mL-1）-時間t（h）圖5。

2.2藥動學參數(shù)

單次空腹口服鹽酸馬尼地平片10mg、單次空腹口服鹽酸馬尼地平片20mg和餐后口服鹽酸馬尼地平片20mg后馬尼地平的血藥濃度經DAS2.1.1軟件處理，得到的主要藥動學參數(shù)結果見下表2。

受試者連續(xù)多次給藥7天鹽酸馬尼地平片（10mg/片）的血藥濃度經DAS2.1.1軟件處理，得到的藥動學參數(shù)結果見下表3：

2.3單次、多次給藥藥代動力學參數(shù)分析

2.3.1血藥濃度-時間曲線

12名志愿者（男女各6人）空腹口服10mg、20mg和餐后口服20mg鹽酸馬尼地平片后，其馬尼地平的平均血藥濃度C（ng·mL-1）-時間t（h）如圖6-圖8；以及11名志愿者連續(xù)多次給藥7天鹽酸馬尼地平片（10mg/片），其馬尼地平的血藥濃度C（ng·mL-1）-時間t（h）圖9。

2.3.2男女受試者藥動學參數(shù)比較

男女受試者單次給藥10mg、20mg、餐后給藥20mg和連續(xù)多次給藥10mg后主要藥動參數(shù)均值如下表4：

空腹口服鹽酸馬尼地平片10mg、20mg、餐后口服鹽酸馬尼地平片20mg和連續(xù)多次給藥后男女藥動學參數(shù)AUC、Cmax 、Tmax比較p>0.05無統(tǒng)計學意義。

2.3.3單次空腹和餐后口服鹽酸馬尼地平受試者藥動學參數(shù)比較

空腹單次口服10mg與空腹單次口服20mg比較，Cmax、AUC0-t均增大約一倍，Tmax無明顯差異；餐后口服20mg與空腹口服20mg比較，Tmax明顯變大，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了約一倍。

2.3.4單次空腹口服和連續(xù)給藥鹽酸馬尼地平受試者藥動學參數(shù)比較

受試者單次口服10mg和多次連續(xù)口服鹽酸馬尼地平片后藥代動力學參數(shù)比較見下表5：

結果顯示，多次給藥與單次比較Cmax、AUC、Tmax （p>0.05），均無統(tǒng)計學意義。

3結論

健康受試者按試驗設計服用不同劑量的鹽酸馬尼地平片后，空腹單次口服10mg與空腹單次口服20mg藥動學參數(shù)比較，Cmax、AUC0-t均增大約一倍，Tmax無明顯差異。空腹、餐后和連續(xù)多次口服鹽酸馬尼地平片后男女藥動學參數(shù)比較p>0.05，均無統(tǒng)計學意義。餐后口服20mg與空腹口服20mg后藥動學參數(shù)比較顯示，食物明顯延長Tmax，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了約一倍。按10mg/每次，每日1次，連續(xù)用藥7日給藥方案，受試者多次口服鹽酸馬尼地平后，第4，5，6，7日的谷濃度接近，即多次服藥后血濃度達到穩(wěn)態(tài)。多次口服鹽酸馬尼地平與單次口服給藥的Cmax、AUC的p>0.05無統(tǒng)計學意義，繼而說明多次連續(xù)給藥后，鹽酸馬尼地平在體內無蓄積。

4討論

加入100%eL氫氧化鈉（1mol·L-1）的目的：采用的離子模式是正離子的ESI源，要求樣品具有堿性，并且鹽酸馬尼地平在酸性條件下萃取低，所以加入1mol·L-1氫氧化鈉堿化鹽酸馬尼地平后，回收率明顯提高，且有了較大的峰面積。

本研究在血漿處理過程中對提取溶劑作了考察，比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙醚對樣品的提取效，發(fā)現(xiàn)用正己烷提取效果均不好，嘗試用正己烷：二氯甲烷=3：1，正己烷：乙酸乙酯=3：1，發(fā)現(xiàn)正己烷：乙酸乙酯=3：1提取效果比以上都好，調節(jié)正己烷：乙酸乙酯=2：1和正己烷：乙酸乙酯=1：1發(fā)現(xiàn)提取效果最好的為2：1，因此采用正己烷：乙酸乙酯=2：1作為提取劑。

流動相和色譜柱的選擇：用甲醇：0.1%甲酸=85：15，色譜柱用菲羅門2.0？00mm，C18柱，峰形很差，改變流動相為5mmoL/L乙酸銨溶液（含0.5%的冰乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，峰形較好，但是在進處理后的血漿樣品時，發(fā)現(xiàn)基質干擾嚴重，換用菲羅門4.6？50mm，C18柱，無明顯基質干擾，但是峰形變差，換用ZORBAX RX-C8 4.6？50 mm，5%em（Agilent）色譜柱，峰形較好，無明顯基質干擾，所以最后選擇流動相為5mmoL/L乙酸銨溶液（含0.5%的冰乙酸）：甲醇：乙腈=15：40：45，色譜柱為ZORBAX RX-C84.6？50 mm，5%em（Agilent）。

本研究建立的LC-MS/MS方法，具有操作簡便、快速、準確等特點， 用此法完成單次、多次給藥藥動學試驗血漿樣本的檢測，通過二隔室模型法得到了相應的藥動學參數(shù)，通過對藥動參數(shù)進行分析，得到空腹單次口服10mg與空腹單次口服20mg藥動學參數(shù)比較，Cmax、AUC0-t均增大約一倍，Tmax無明顯差異；空腹、餐后和連續(xù)多次口服鹽酸馬尼地平片后男女藥動學參數(shù)比較均無顯著差異；食物明顯延長Tmax，Cmax和AUC0-t餐后比空腹均增大了約一倍。因為高脂餐后，一方面能降低胃排空速率，增加藥物在胃內的停留時間，另一方面高脂肪飲食可促進膽汁的分泌，提高藥物的吸收。但目前食物對藥物生物利用度及藥代動力學方面的研究在國內并未引起足夠的重視，尤其是現(xiàn)在仿制藥的大量出現(xiàn)，我們更應該考慮空腹和餐后的生物利用度及藥代動力學是否等效。此外多次連續(xù)給藥在體內無蓄積，從而為臨床合理用藥提供依據(jù)。

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