正交設(shè)計(jì)研究山牡荊總黃酮提取工藝

代現(xiàn)平，班翠紅，韓景田

摘要[目的]建立山牡荊總黃酮的合理提取工藝，為山牡荊的開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。[方法]以乙醇用量、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取次數(shù)等為考察因素，以山牡荊總黃酮含量作為指標(biāo)，應(yīng)用正交試驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]山牡荊中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇用量12倍量、乙醇濃度70%乙醇、提取次數(shù)3次、每次1 h。[結(jié)論]該提取工藝簡單、高效，適用于山牡荊的總黃酮提取。

關(guān)鍵詞 山牡荊；總黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07748-02

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170320）。

作者簡介 代現(xiàn)平（1970-），男，河南鶴壁人，副教授，博士，從事天然活性成分研究。

收稿日期20140702牡荊屬植物Vitex是馬鞭草科喬木或灌木，全世界大約有250余種，主要分布在熱帶及溫帶地區(qū)。在我國有14種，主要分布于長江以南，在東北、西北、華北等地也有少量分布[1]。山牡荊（Vitex quinata）一般以其樹干心材和干燥根入藥，具有止咳定喘、清熱解毒及鎮(zhèn)靜退熱等功效，常用于癰腫瘡瘍、溫病發(fā)熱、風(fēng)濕熱痹、關(guān)節(jié)紅腫熱痛及熱毒血痢等病癥[2]。研究顯示，山牡荊及牡荊屬植物主要含有黃酮類、苯丙素類、甾類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、二萜類、倍半萜類等化學(xué)成分[3-8]。其中黃酮類化合物，因其廣泛的生物活性已成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，山牡荊的黃酮類成分具有如抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、止咳祛痰等多種藥理作用[3-8]。因此，研究山牡荊中總黃酮的提取工藝具有重要意義。筆者以山牡荊總黃酮作為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，對影響提取的各種條件及因素進(jìn)行了深入探討，為山牡荊總黃酮提取工藝的研究及山牡荊總黃酮開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 山牡荊（煙臺綠葉制藥，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物實(shí)驗(yàn)室鑒定為真品）；對照品蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所）；其他試劑為分析純試劑。

1.2儀器 JA5003B電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；SHZⅢ循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）；TU190紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）；HH6型恒溫水浴鍋（上海喬躍電子有限公司）；DHG9053型真空干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）；RE301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備方法。準(zhǔn)確稱取山牡荊粗粉30 g，于1 000 ml燒瓶中，按要求加入提取溶劑，加熱回流提取一定時(shí)間，過濾，減壓回收溶劑，干燥，稱重，得山牡荊干膏。精密稱取在不同提取條件下所得山牡荊干膏10 mg，于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法。精密稱取于120 ℃干燥至恒重蘆丁對照品10 mg，于100 ml容量瓶中，加60%乙醇30 ml，水浴微熱使溶，放冷，60%乙醇定容至100 ml，制成0.100 mg/ml蘆丁對照品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。分別精密吸取蘆丁對照品溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml，分別于25 ml容量瓶中，各加0.75 ml亞硝酸鈉溶液（50 mg/ml），搖勻，靜置7 min；再加0.75 ml硝酸鋁溶液（100 mg/ml），搖勻，靜置7 min；再加10 ml氫氧化鈉溶液（40 mg/ml），60%乙醇定容，搖勻，靜置8 min。于510 nm波長處測吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。

1.3.4 精密度試驗(yàn)。 精密吸取2.0 ml蘆丁對照液于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法，重復(fù)操作5次。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取適量供試品溶液，按“1.3.3”方法，于0、2、4、6、8 h分別測定吸光度。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批藥材，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，并按“1.3.3”所述方法測定吸光度，重復(fù)5次。

1.3.7 回收率試驗(yàn)。精密移取6份已知含量供試品溶液各0.5 ml，均精密加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.3.3”方法測定其吸光度，計(jì)算山牡荊總黃酮含量。

1.3.8 供試品總黃酮含量測定。精密移取5 ml供試品溶液，于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法測吸光度，并代入回歸方程，計(jì)算總黃酮的含量。

1.3.9 正交試驗(yàn)。應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇了乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取次數(shù)（C）和提取時(shí)間（D）作為考察因素，每個(gè)因素選擇了3個(gè)水平（），以總黃酮含量作為考核指標(biāo)，按照L9（34）正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山牡荊中總黃酮的含量測定經(jīng)計(jì)算，以吸光度A為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=12.473C+0.001 9（r=0.999 6），表明蘆丁在0.005～0.049 mg/ml濃度范圍與其吸光度呈良好線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，5次吸光度值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%，表明該方法有良好精密度。穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5次吸光度值的RSD為1.36%，表明在8 h內(nèi)測定供試品基本穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)中5次吸光度值的RSD為1.73%；回收率試驗(yàn)得出平均回收率97.59%，RSD=1.55%，表明該方法有良好重現(xiàn)性。

2.2 山牡荊總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)。極差分析表明（），影響山牡荊總黃酮的提取主次因素依次為B>A>C>D，即乙醇用量>乙醇濃度>提取次數(shù)>提取時(shí)間；方差分析（）顯示，乙醇濃度、乙醇用量對結(jié)果影響具有極顯著性的意義，提取次數(shù)對試驗(yàn)結(jié)果影響有顯著意義。正交設(shè)計(jì)結(jié)果（）顯示，提取工藝A1B2C3D2為最佳，但D因素影響小，且3個(gè)水平相差不大，為了節(jié)省能源，選用D1。因此，最佳工藝確定為70%乙醇12倍量加熱回流提取3次，每次1 h。

2.2.2 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。采用篩選后得到的最佳工藝，即A1B2C3D1提取3次，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，按“1.3.3”方法測吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批山牡荊總黃酮的含量分別為40.32、39.02、39.56 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.65%（n=3），表明該工藝路線是穩(wěn)定可靠的。

3 結(jié)論

筆者曾進(jìn)行了山牡荊藥材粒度、提取時(shí)間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數(shù)單因素的篩選試驗(yàn)，結(jié)果顯示山牡荊粒度對提取效率的影響不大，因此選擇對提取效率有較大影響的乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇用量為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選其最佳提取工藝條件。經(jīng)正交設(shè)計(jì)結(jié)果分析及方差分析，發(fā)現(xiàn)影響山牡荊總黃酮提取主次因素依次為乙醇用量>乙醇濃度>提取次數(shù)>提取時(shí)間，經(jīng)綜合各種因素后，選定A1B2C3D1為山牡荊總黃酮的最佳提取方案，即70%濃度12倍量乙醇經(jīng)加熱回流提取3次，每次1 h，按此條件提取，總黃酮含量較高。并按照最佳提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該提取工藝方法簡單、高效、穩(wěn)定。

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