蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)的研究

華海霞

摘要

采用1/2MS培養(yǎng)基，以蝴蝶蘭果莢為外植體進(jìn)行快速繁殖的研究。對(duì)蝴蝶蘭快速繁殖各階段的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳外植體為果莢，培養(yǎng)基的最適pH為5.8;各階段最佳培養(yǎng)基濃度，誘導(dǎo)原球?yàn)?/2MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA，原球莖增殖為1/2MS+3.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L NAA，誘導(dǎo)原球莖分化為1/2MS+1.0 ?mg/L 6BA + 0.2 ?mg/L NAA，誘導(dǎo)生根為1/2MS+ 0.6 mg/L IBA。此外，培養(yǎng)基中還需加入10%的香蕉泥上清液、蔗糖2%、瓊脂0.8%、活性炭2.0 g/L效果最好。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭;叢生芽;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S682.31 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12059-02

蝴蝶蘭是國(guó)際上最具有商業(yè)價(jià)值的四大觀賞熱帶蘭之一。但其種子無(wú)胚乳，自然條件下很難萌發(fā)，用常規(guī)的無(wú)性繁殖，增殖速度慢，難以滿足市場(chǎng)的需求，因此研究蝴蝶蘭的快速繁殖途徑具有重要意義。用組培方法直接采用無(wú)菌幼苗誘導(dǎo)原球莖，具有取材方便、操作簡(jiǎn)單、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，能在短時(shí)間內(nèi)大量培育蝴蝶蘭。筆者分別以蝴蝶蘭的果莢、莖尖、葉片3種外植體為組織培養(yǎng)材料，采用1/2MS培養(yǎng)基，其配制時(shí)將MS培養(yǎng)基的大量元素減半，其他組成不變[1]，對(duì)蝴蝶蘭叢生芽組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 原球莖的誘導(dǎo)增殖與繼代培養(yǎng) 將原球莖在未分化時(shí)切開進(jìn)行繼代培養(yǎng)。原球莖不宜切得過(guò)小，2～3個(gè)為宜，一般30 d左右須轉(zhuǎn)接1次，這樣既可以擴(kuò)大繁殖系數(shù)，也可以有效地抑制培養(yǎng)基褐化。在1/2MS培養(yǎng)基中添加1.0、1.5、2.0、2.0、3.0 ?mg/L 6BA和0.2、0.2、0.4、0.2、0.2 mg/L NAA，組成5個(gè)處理，比較增殖結(jié)果，確定最佳的激素濃度。

1.2 原球莖的分化

將原球莖接種到分化培養(yǎng)基上，可進(jìn)一步誘導(dǎo)其分化，長(zhǎng)出幼芽，設(shè)計(jì)0.5、0.5、1.0、1.0、1.5 mg/L 6BA和0、0.5、0.2、0.5、0.2 mg/L的NAA組合，比較原球莖的分化情況，得出最佳激素濃度配比[2]。

1.3 誘導(dǎo)生根 將具有2～3片小葉的大芽接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，分化形成完整的植株。分別設(shè)定0.2、 0.5 、1.0 ?mg/L IBA和0.2、 0.5及 1.0 mg/L NAA處理，研究其對(duì)生根的影響。培養(yǎng)28 d后觀察并計(jì)算生根率[3]。

1.4 煉苗與移栽

當(dāng)蝴蝶蘭幼苗長(zhǎng)至3～4片葉、4～5條根，且形體健壯時(shí)，打開封口膜在室溫下煉苗7 d，栽培介質(zhì)宜選水苔，其提前消毒浸泡4 h[2]。移栽時(shí)將小苗輕輕夾出培養(yǎng)瓶，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1%的高錳酸鉀水溶液浸泡5 min，自然晾干后移栽。注意控制栽培環(huán)境，溫度保持在25～29 ℃，相對(duì)濕度保持在80%，低光照。14 d后，逐步提高光照強(qiáng)度。30 d后轉(zhuǎn)入常規(guī)栽培管理，成苗率可在85%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖的誘導(dǎo)

2.1.1 激素濃度對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響。

以果莢的種胚為外植體進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)，采用1/2MS培養(yǎng)基，6BA和NAA的濃度見表1[4]。

由表1可知，NAA對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響不大，而6BA的影響顯著。隨著6BA濃度的增加，原球莖增殖數(shù)量增多，顆粒也飽滿，當(dāng)6BA 2.0 mg/L、NAA0.5 mg/L時(shí)，原球莖形態(tài)最佳。而當(dāng)6BA超過(guò)2.0 mg/L時(shí)，增殖量雖然增加，但顆粒變小，顏色也開始由綠變黃。研究認(rèn)為，低濃度6BA更有利于原球莖的增殖。NAA對(duì)原球莖增殖分化影響不明顯。低濃度的NAA對(duì)原球莖增殖有促進(jìn)作用，高濃度的則不利[5]。所以原球莖誘導(dǎo)的最佳激素濃度為6BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L。

表1 各激素組合誘導(dǎo)原球莖的結(jié)果比較

編號(hào) 6BA

mg/L NAA

mg/L原球莖的形態(tài)

①0.50.2 顆粒小，數(shù)量少，顏色發(fā)黃

②0.51.0顆粒小，數(shù)量少，顏色微黃

③1.00.2顆粒中等，數(shù)量少，顏色微黃

④1.01.0顆粒中等，數(shù)量少，顏色微綠

⑤2.00.2質(zhì)量中等，數(shù)量多，顏色鮮綠

⑥2.00.5顆粒大，數(shù)量多，顏色翠綠

⑦3.00.2顆粒小，數(shù)量多，顏色微綠

⑧3.00.5顆粒小，數(shù)量多，顏色微黃

2.1.2

蔗糖濃度對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響。

蔗糖作為培養(yǎng)基中的碳源，既為培養(yǎng)基提供能源物質(zhì)又起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。試驗(yàn)中蔗糖濃度分別為1.0%、2.0%、3.0%，新增原球莖的個(gè)數(shù)分別為54、80、35，原球莖形態(tài)分別為顆粒中等，顏色微綠;顆粒大，顏色鮮綠;顆粒中等，顏色微黃。可見添加1.0%和2.0%蔗糖時(shí)，新增原球莖數(shù)為54、80個(gè)，且原球莖呈綠色、顆粒狀。當(dāng)蔗糖濃度增加到3.0%時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)基滲透壓較高，前期不利于原球莖的誘導(dǎo)。故最佳的蔗糖濃度應(yīng)為2.0%。

2.2 原球莖的增殖

選取1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L的6BA和0.2 mg/L的NAA組合（分別為1、2、3、4號(hào)培養(yǎng)基），原球莖的增殖快慢比較結(jié)果：1.5～2.0 mg/L的6BA有利于原球莖的增殖，繁殖速度較快，增殖數(shù)量較多，2.0 mg/L時(shí)效果最佳;濃度超過(guò)2.0 mg/L時(shí)，不利于其增殖，繁殖速度慢。NAA對(duì)原球莖的增殖作用不明顯，但低濃度的NAA有協(xié)同作用[6]。所以最佳原球莖增殖培養(yǎng)基為 1/2MS+ 6BA 2.0 ?mg/L+ NAA 0.2 mg/L。 不同激素濃度的4種培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖的影響見圖1。

注：a.1號(hào)培養(yǎng)基;b.2號(hào)培養(yǎng)基;c.3號(hào)培養(yǎng)基;d.4號(hào)培養(yǎng)基

圖1 不同激素濃度對(duì)原球莖增殖的影響

2.3 原球莖的分化增殖

原球莖的分化及增殖所需6BA和NAA的濃度相對(duì)較原球莖誘導(dǎo)及增殖的濃度要低，且兩者的比值也小。6BA與NAA的濃度組合及分化結(jié)果見表2。

由表2可知，原球莖的增殖與分化主要取決于6BA濃度的大小。低濃度的6BA有利于分化，6BA濃度超過(guò)2.0 mg/L時(shí)，不促進(jìn)增殖。NAA的作用亦不顯著，但不加入NAA時(shí)，原球莖也難以分化出芽。所以最佳原球莖分化激素濃度為6BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L。不同激素濃度處理對(duì)原球莖分化結(jié)果見圖2。

表2 不同激素濃度對(duì)原球莖分化的影響

編號(hào)6BA∥mg/L ?NAA∥mg/L觀察結(jié)果

①0.50極少數(shù)分化

②0.50.5少數(shù)分化

③1.00.2完全分化

④1.00.5多數(shù)分化

⑤1.50.2部分增殖

⑥2.00.5多數(shù)增殖

圖2 不同激素濃度對(duì)原球莖分化的影響

2.4 誘導(dǎo)生根

2.4.1 不同激素對(duì)誘導(dǎo)生根的影響。選用IBA和NAA 2種激素進(jìn)行誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)基組成及生根情況見表3。

由表3可知，IBA和NAA均能誘導(dǎo)生根，但兩者相比，IBA誘導(dǎo)生根的效果比NAA更好，生根率高達(dá)90%。所以最佳誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為1/2MS外加激素IBA。

表3 誘導(dǎo)生根的結(jié)果比較

編號(hào)基本培養(yǎng)基IBA

mg/L生根率

%平均根數(shù)

條

①1/2MSIBA 0.2502～3

②1/2MSIBA 0.5904～5

③1/2MSIBA 1.0843～4

④1/2MSNAA 0.2402～3

⑤1/2MSNAA 0.5633～4

⑥1/2MSNAA 1.0582～3

2.4.2

不同濃度的IBA對(duì)誘導(dǎo)生根率的影響。由表4可知，幼苗開始生根天數(shù)隨IBA濃度的增加而縮短，IBA濃度為0.4～0.6 mg/L時(shí)，隨IBA濃度的增加，組培苗的生根率、每株根數(shù)增加。當(dāng)IBA濃度超過(guò)0.6 mg/L時(shí)生根率開始下降。綜合比較，以IBA 0.6 mg/L組培幼苗的生根效果最好，為28 d左右，根數(shù)平均有4～5條，根長(zhǎng)達(dá)3.5 cm，小苗生長(zhǎng)發(fā)育正常。

2.5 煉苗與移栽

蝴蝶蘭對(duì)溫度要求比較嚴(yán)格，最適栽培溫度為白天25～28 ℃，夜間18～10 ℃，蝴蝶蘭不適于強(qiáng)烈陽(yáng)光下生長(zhǎng)，夏天要用遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔽陽(yáng)光;基質(zhì)選用水苔作基質(zhì)的盆栽法，主要適用多孔塑料盆，盆高最好小于直徑，盆下部用小塊泡沫填充以利排水，上面用水苔填充，將小苗栽植于盆中，切不可壓得太緊，以防爛根;蝴蝶蘭在溫度適宜條件下生長(zhǎng)迅速，因此，其需肥量比其他蘭花稍多，主要以液肥為主，春天適當(dāng)多施，夏秋少施。

表4 不同濃度IBA的誘導(dǎo)生根的比較

IBA

mg/L生根率

%平均根

數(shù)∥條根長(zhǎng)

cm開始生根

天數(shù)∥d

0.2581/24.236

0.4862/33.933

0.6984/53.528

0.8894/52.825

1.0843/41.721

3 結(jié)論與討論

研究表明，誘導(dǎo)原球莖的最佳外植體為果莢，且果莢生長(zhǎng)期為4個(gè)月最好;采用1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖2.0%、瓊脂0.8%、有機(jī)添加物為10%香蕉泥的上清液最佳;添加活性炭2.0 g/L防止褐化效果最好。蝴蝶蘭組織

培養(yǎng)添加激素為6BA、NAA和IBA，各階段最佳激素及濃度