微孢子蟲糖蛋白的研究進展

吳海晶 耿莉娜 周澤揚

摘要 隨著蛋白質(zhì)組學和糖組學研究的迅速發(fā)展，糖蛋白已成為眾多研究的中心。糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)直接影響其功能，因此糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)研究成為糖生物學研究的重點之一。就糖蛋白研究的基本策略方法作了簡要介紹，并且簡要概括了近年來微孢子蟲糖蛋白的研究進展。

關鍵詞 糖蛋白;糖鏈;分離鑒定;結(jié)構(gòu)分析;質(zhì)譜;核磁共振

中圖分類號 S182 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12017-03

Research Progress of Glycoprotein in Microsporidia

WU Haijing1， GENG Lina2， ZHOU Zeyang3* ?（1. Chongqing University of Technology， Chongqing 400054; 2. Chongqing Tobacco Science Research Institute， Chongqing 400715; 3. The State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology， Southwest University， Chongqing 400715）

Abstract ?With the rapid development of proteomics and glycomics research， glycoprotein has become the center of many studies. And the complex function of glycoprotein attribute to its diverse structure which was one of the important content of glycobiology. The recent research on global methods for protein glycosylation analysis were introduced. Finally this review covers aspects of the progress of glycoprotein in microsporidia.

Key words ?Glycoprotein; Sugar chain; Isolation and identification; Structure analysis; Mass spectrometry; NMR spectroscopy

基金項目 國家自然科學基金（NO.30930067，31270138，31101770）。

作者簡介

吳海晶（1986- ），女，河北邯鄲人，助教，碩士，從事微生物基因組與次生代謝方面的研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事家蠶分子生物學、家蠶病原生物學方面的研究。

收稿日期 20141027

蛋白質(zhì)糖基化修飾是真核生物蛋白質(zhì)最常見的翻譯后修飾。研究發(fā)現(xiàn)，有近一半以上的蛋白質(zhì)都有可能存在著糖基化的修飾。正在合成的蛋白質(zhì)或合成后的蛋白質(zhì)在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，可以將活化的單糖或多糖加到該肽鏈上[1]。糖鏈的形成往往改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進而改變蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)的糖基化作用對該蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生重要的影響，例如在蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定、折疊、運輸及定位等方面起著重要作用;多數(shù)蛋白質(zhì)表面的糖鏈都能夠誘發(fā)特定的免疫反應，且與免疫相關的關鍵分子幾乎都是糖蛋白;大多數(shù)微生物依靠糖鏈為介導，進而黏附到宿主細胞表面，如許多革蘭氏陰性菌的黏附就是由細菌黏附素、宿主糖鏈相互作用介導的，并由此決定病原微生物的宿主范圍和組織趨向;糖蛋白還參與受體激活，信號轉(zhuǎn)導，細胞分化、增殖、凋亡及衰老，精卵識別等眾多重要的生物進程[2]。自20世紀末提出“糖組學”（Glycomics） 概念以來，人們就將研究對象鎖定為糖蛋白，主要研究蛋白質(zhì)糖基化的基因信息、糖基化的位點信息、糖基化的結(jié)構(gòu)信息及功能信息。而糖鏈結(jié)構(gòu)的復雜性極大地制約了糖蛋白的研究速度。

1 糖蛋白的類型

糖蛋白是由長度較短、帶分支的寡糖同多肽鏈經(jīng)過共價連接形成的蛋白。通常，糖蛋白中的糖鏈可分為直鏈和分支鏈，糖基數(shù)一般有1～15個不等，當然也有20個糖基的巨寡糖存在。不同的糖蛋白分子糖鏈的數(shù)目是不相同的，而且分布也很不均勻。糖蛋白中的糖鏈可根據(jù)糖肽鍵的類型分為N連接的糖鏈、O連接的糖鏈兩大類，分別簡稱為N糖鏈和O糖鏈。這兩類糖鏈可單獨或同時出現(xiàn)在同一糖蛋白中。它們在結(jié)構(gòu)上各自有自己的特點。

1.1 N連接的糖鏈

N連接糖蛋白是由寡糖中的N乙酰葡萄糖與多肽鏈中天冬酰胺殘基的酰胺氮連接而形成的。通常，含有潛在的糖基化位點AsnXSer/Thr（X是脯氨酸以外的任何氨基酸） 3 個氨基酸殘基組成的一個序列段;N糖鏈由五糖核心結(jié)構(gòu)（N連接的糖蛋白鏈均含此結(jié)構(gòu)）連接其他糖的情況，通常可分為3 類：高甘露糖型，是由N乙酰葡糖胺（GlcNAc） 和甘露糖組成，在五糖核心上再連接上2～9個甘露糖，如卵蛋白;復雜型，除N乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖外，還有半乳糖、果糖、唾液酸與五糖核心相連;雜合型（混合型）是既有高甘露糖鏈又有N乙酰氨基半乳糖鏈共同連接在五糖核心結(jié)構(gòu)上。

1.2 O連接的糖鏈

O連接糖蛋白是由寡糖中N 乙酰半乳糖與多肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基相連而形成的。O糖鏈的結(jié)構(gòu)比N糖鏈的結(jié)構(gòu)相對簡單一些，但是O連接的糖鏈也存在多種連接形式。這些結(jié)構(gòu)具有一個共同點，即由一個或少數(shù)幾種單糖與某些含羥氨基酸相連接，大體分為巖藻糖Fuc 和Ser/Thr的OH 連接、N乙酰葡糖胺（GlcNAc）和Ser/Thr 的OH連接、 N乙酰半乳糖胺（GalNAc） 和Ser/Thr 的OH連接。不存在共有的核心結(jié)構(gòu)，但在GalNAcSer（Thr）形式糖鏈中至少已發(fā)現(xiàn)6種核心結(jié)構(gòu)。

2 糖蛋白的研究方法

蛋白質(zhì)的糖基化修飾分析是糖蛋白研究的重要部分，目前國內(nèi)外許多學者已開展了糖蛋白質(zhì)組學的研究。據(jù)文獻報道，現(xiàn)在研究糖蛋白的技術(shù)一般是使用凝集素親和層析的方法分離得到糖蛋白，經(jīng)電泳染色分析糖蛋白，釋放糖鏈，最后使用質(zhì)譜等方法分析其結(jié)構(gòu)。

2.1 糖蛋白/糖肽分離純化

常用凝集素親和層析法來進行糖蛋白和糖肽的分離純化。 不同來源的植物凝集素對不同結(jié)構(gòu)的糖鏈具有特異的親和性。許多凝集素已被分離出來，并應用于商品化，如菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA） 能夠與N乙酰半乳糖胺進行結(jié)合;麥芽凝集素（Wheat germ agglutinin，WGA）可以同 N乙酰葡糖胺、N乙酰半乳糖胺和N乙酰神經(jīng)氨酸進行結(jié)合;刀豆蛋白A（Concanavalin A，Con A） 可以特異性地結(jié)合D甘露糖、D半乳糖和N乙酰葡糖胺單糖，識別N聚糖糖蛋白，在結(jié)合糖蛋白的同時結(jié)合單糖和糖脂;大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）特異性結(jié)合D半乳糖和N乙酰半乳糖胺[3]。這幾種凝集素可以配合使用。2008年Cosima等[4]研究血清中糖蛋白的性質(zhì)，先使用刀豆蛋白A（Con A）、麥芽凝集素（WGA）和黑接木骨凝集素（SNA）3種凝集素分別進行親和層析，然后組合進行親和層析，得到糖蛋白，成功地鑒定得到45種蛋白質(zhì)中86個N糖基化位點。糖蛋白也可以經(jīng)凝膠電泳后染色來鑒定。常用的染色方法有PAS（過碘酸Schiff）法、銀染法、熒光染色法，也可以使用凝集素印跡（lectin blot）特異地對不同糖蛋白進行顯色識別[5]。

2.2 糖鏈的釋放

糖鏈的釋放一般存在化學釋放和酶釋放2種方法。我們分別稱之為化學法和酶法。

N連接聚糖常使用肽N糖苷酶F（PNGase F）對其進行水解。它是一種酰氨酶，能在N糖蛋白的高甘露糖、雜合或復合寡糖部分的最內(nèi)側(cè)N乙酰半乳糖胺（GalNAc）和天冬酰氨殘基之間進行切割。與此同時，令天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?，進而造成其相對分子質(zhì)量增加0.98，起到質(zhì)量標記N糖基化位點的作用。而對O連接聚糖目前只有一種酶，內(nèi)切αN乙酰半乳糖胺酶即 O糖苷酶，斷裂N乙酰半乳糖胺（GalNAc） 和Ser/Thr 連接。化學法有肼解法和β消除法。肼解法用于釋放含N乙酰氨基葡萄胺（GlcNAc）和Asn連接的糖蛋白。β消除反應被廣泛應用于含N乙酰半乳糖胺和絲氨酸或蘇氨酸（GalNAcSer/Thr）連接的糖蛋白。

2.3 糖鏈的結(jié)構(gòu)分析

質(zhì)譜（MS）技術(shù)和核磁共振（NMR）技術(shù)是糖鏈結(jié)構(gòu)解析方面應用最廣泛的2種技術(shù)。這2種技術(shù)各有其利弊，在實際的使用中經(jīng)?；パa。近幾年來，對糖蛋白中糖鏈部分的分析方法有相關報道，但是沒有一些突破性的進展。在當前研究環(huán)境下，不具備規(guī)模化直接分析糖鏈組成、結(jié)構(gòu)的相關技術(shù)條件。這也成為糖蛋白的研究長期以來滯后于核酸、蛋白研究的一個主要原因。

2.3.1 生物質(zhì)譜法。

質(zhì)譜是目前應用比較廣泛的一項技術(shù)。它可以對糖鏈進行結(jié)構(gòu)分析，進而解析糖鏈的結(jié)構(gòu)[6]。電噴霧質(zhì)譜（ESIMS） 和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS） 具有獨特的“軟電離”方式，能夠很好地對難揮發(fā)、高極性、熱不穩(wěn)定的糖等生物大分子進行結(jié)構(gòu)分析，進而被稱為生物質(zhì)譜。在糖鏈結(jié)構(gòu)的研究中，ESIMS無需衍生化就可以確定出糖鏈的組成結(jié)構(gòu)，但是易受到樣品和溶劑中干擾物的影響;MALDITOFMS 因其對干擾物忍受力強、產(chǎn)生的碎片離子少以及圖譜沒有ESIMS 中的多電荷特性而更易解析等優(yōu)點而成為目前研究糖鏈結(jié)構(gòu)解析的常用工具[6]。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展以及多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應用，對糖蛋白的研究尤其是對寡糖鏈結(jié)構(gòu)的研究更加準確、簡便。一般，ESIMS 和MALDIMS可借助碰撞誘導解吸（CID）、源后衰變（PSD）等相關技術(shù)盡可能獲得詳盡的糖鏈結(jié)構(gòu)信息[7]。2008年Cosima等[4]使用MALDITOF MS 和LCESIMS/MS質(zhì)譜分析了由凝集素親和層析和親水色譜柱富集到的血清中糖蛋白，結(jié)合2種方法，共得到38種蛋白中的63個糖基化位點，證明2種方法存在的差異可以互為補充。另外，傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（FTICR） 也具有高靈敏度和分辨率，其質(zhì)量精確度高達1×10-6，可與2DE 一起使用來分析糖蛋白。2004年Froesch等[8]結(jié)合全自動芯片電噴霧和傅里葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜這兩項技術(shù)，用于糖組學的研究。2006年Vakhrushev等[9]利用傅里葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜分析尿液，診斷先天性糖蛋白糖基化缺陷（Congenital disorders of glycosylation，CDG）和其他疾病。

MS的靈敏度非常高，能夠精確地測定質(zhì)量，在某種情況下可以得到糖鏈序列相關的信息。但是，與普通蛋白不同的是，糖蛋白的分子結(jié)構(gòu)通常是不均一的，包括糖鏈的微不均一以及糖基化位點的不均一。這些不均一性給糖蛋白的質(zhì)譜測定帶來很大困難，嚴重影響質(zhì)譜分析的靈敏度，而且MS不能區(qū)分參與糖鏈構(gòu)造中各種單糖的同分異構(gòu)體，也不能提供出糖鏈的連接位置、差向異構(gòu)等結(jié)構(gòu)方面的相關信息。

2.3.2 核磁共振法（NMR）。

目前，NMR 技術(shù)是糖鏈立體化學結(jié)構(gòu)分析中一種最重要的技術(shù)方法，可以確定出糖鏈的構(gòu)型、連接位置、分支和微觀多樣性。

早在1983年Vliegenthart等[10]就利用高分辨率的1HNMR技術(shù)對與天冬酰胺連接的糖肽進行研究。由于NMR 測定訊號峰重疊嚴重，解析較難，靈敏度不高，且對樣品純度要求極高，多維NMR 需要樣品為毫克級，對大多數(shù)糖復合物中的微量糖鏈來講是很難達到的，因此在蛋白質(zhì)糖基化分析中的應用并不廣泛。但是，NMR在糖鏈結(jié)構(gòu)的檢測特別是糖鏈的連接方式以及分支結(jié)構(gòu)分析的優(yōu)點，促進NMR在糖基化分析中的發(fā)展[11]。Shaw 等[12]使用二維1HNMR技術(shù)對維持花生過氧化物酶穩(wěn)定的3個糖鏈進行了結(jié)構(gòu)分析。Yamaguchi等[13]使用核磁共振二維核歐沃豪斯增益譜（13C13C NOESY）、核磁共振總相關譜（13C13C TOCSY）和1HNMR技術(shù)相結(jié)合來進行較大糖蛋白的糖鏈分析。目前已經(jīng)出現(xiàn)了納米NMR用于組織細胞復雜糖鏈的分析[14]。

最近有科學家將微陣列技術(shù)（Microarray） 引入糖蛋白組學研究，可廣泛用于糖蛋白的糖鏈分析，以對生物個體產(chǎn)生的全部蛋白聚糖結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)鑒定與表征[15]。Pilobello 等[16]將凝集素固定在芯片上，建立了凝集素微陣列技術(shù)，以快速分析糖基化蛋白質(zhì)。雖然目前糖芯片技術(shù)尚未成熟，不能夠大規(guī)模地應用到生物學研究中，但是隨著糖基數(shù)據(jù)庫的完善同質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展結(jié)合使用，必將逐步成為能夠廣泛應用的生物芯片技術(shù)。

3 微孢子蟲糖蛋白研究進展

微孢子蟲的孢壁作為最先與宿主細胞接觸的部分在孢子侵染宿主過程中扮演著重要角色。而孢壁蛋白對微孢子蟲的侵染有著直接的關系，但其作用機理還不明確，微孢子蟲孢子壁、極帽、極膜層以及極管上存在一些糖蛋白、糖結(jié)合物。2005年，Hayman等[17]發(fā)現(xiàn)

腸道微孢子蟲（E.intestinalis）利用宿主細胞表面的硫酸化的GAGs（糖胺聚糖）特異性地黏附到宿主細胞表面，而且微孢子蟲利用這種機制增加了對宿主細胞的感染，并且發(fā)現(xiàn)添加外源性的硫酸聚糖可以降低孢子的感染率。2007年Southern等[18]得到了腸道微孢子蟲孢壁蛋白 EiEnP1，可以使孢子黏附并感染宿主細胞。EnP1含有3個肝素結(jié)合基序。該基序可能識別并結(jié)合宿主細胞表面的葡聚糖，從而介導孢子黏附和宿主細胞感染，進一步證實在孢子與宿主細胞的黏附過程中主要是利用宿主細胞表面的糖胺聚糖（GAGs）起作用。

在微孢子蟲研究中關于糖蛋白的研究還很少。目前微孢子蟲糖蛋白的生化信息主要來自于凝集素結(jié)合試驗。2001年Hayman等[19]得到腸道微孢子蟲（Encephalitozoon intestinalis）的2個外孢壁蛋白（SWP1，SWP2）。根據(jù)感染細胞的裂解物與ConA（伴刀豆蛋白）或WGA（麥芽凝集素）-包被的磁珠結(jié)合后與特異性的抗體反應檢測結(jié)果，推測含有N糖基化。2003年Xu等[20]通過Con A親和層析的方法得到PTP1， 2004年分析了PTP1的糖基化位點，發(fā)現(xiàn)PTP1的O甘露糖化影響腦炎微孢子蟲（E.hellem）對宿主細胞的感染，加入外源性的甘露糖可以降低孢子的感染率。極絲蛋白1（PTP1）被認為含有O甘露糖基化（Omannosylated），只是因為其與O乙酰葡糖氨（OGlcNAc）的抗體不發(fā)生反應，而在10種凝集素中只與ConA結(jié)合，并且這種結(jié)合可以被NaOH處理去除。這種O甘露糖基化作用（Omannosylation）與相近的物種兔腦炎微孢子蟲（E.cuniculi）的基因組序列分析結(jié)果一致[21]。隨后，2006年Xu等[22]通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)，成功鑒定了20 kDa的SWP3。它定位在孢子內(nèi)壁上。SWP3可能含有糖基磷脂酰肌醇錨定位點 （GPI anchor），通過免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)在孢子繁殖（Sporogony）時處于細胞表面，在成熟孢子中是定位在孢子內(nèi)壁上，還含有一些O糖基化位點，很可能是一種糖基化蛋白。2007年Taupin等[23]利用電子顯微鏡技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)研究兔腦炎微孢子蟲和蝗蟲微孢子蟲（A.locustae）的甘露糖基結(jié)合物（Mannoconjugates）的定位、結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡水平用甘露糖特異性結(jié)合的凝集素標記試驗表明極帽和極膜層是富含甘露糖的糖蛋白的主要區(qū)域，利用質(zhì)譜及核磁共振技術(shù)分析葡聚糖片段確定了聯(lián)接在微孢子蟲蛋白質(zhì)上的寡糖結(jié)構(gòu)為O糖苷鍵連接的線性的甘露糖基化的低聚糖，并且兔腦炎微孢子蟲和蝗蟲微孢子蟲不存在N糖苷或存在的量很少而達不到可檢測的水平。在家蠶微孢子蟲中，2008年吳正理[24]通過質(zhì)譜方法得到14種孢壁蛋白，對其序列進行糖基化位點在線預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/），得到其中有10個假定的孢壁蛋白存在N糖基化位點而無O糖基化位點。這一預測結(jié)果是否正確，還需要進一步的研究。

4 展望

糖蛋白結(jié)構(gòu)復雜，主要是由于糖鏈的結(jié)構(gòu)復雜，不單表現(xiàn)糖鏈序列的多樣，還在于其合成沒有模板，而是經(jīng)過酶促反應在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中生成的。近些來，隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，糖蛋白質(zhì)組學的研究也得到很大的進步。從現(xiàn)階段來看，對于糖蛋白質(zhì)組的研究還主要集中在方法學的開發(fā)和利用方面。對糖基化位點的研究方法也不斷得到改進，但主要問題的解決還要依賴于質(zhì)譜的進一步發(fā)展。該實驗室對家蠶微孢子蟲孢壁蛋白中糖蛋白的研究才剛剛開始。根據(jù)家蠶微孢子蟲孢壁蛋白的預測信息來驗證孢壁蛋白中糖蛋白的類型，尋找其可能發(fā)揮的作用，以期能揭示其侵染宿主的的奧秘。

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