老齡小鼠腦缺血后血管新生缺陷與Fn-α5β1/αVβ3上調不足的關聯(lián)☆

黃恒 黃綺娟 王富鑫 李龍宣※

老齡小鼠腦缺血后血管新生缺陷與Fn-α5β1/αVβ3上調不足的關聯(lián)☆

黃恒*黃綺娟△王富鑫*李龍宣*※

目的 探討老齡小鼠腦缺血后腦內血管上纖維連接蛋白（fibronectin,Fn）及其受體整合素α5β1和αVβ3的表達方式及其與血管新生間的關系。方法選取2月齡（青年）、18月齡（老齡）雄性C57BL/6小鼠為觀察對象。以線栓法制備大腦中動脈栓塞模型，各年齡段分為假手術組（對照組）、腦缺血組，于模型成功后7 d，14 d行免疫熒光染色（各組n=5）。以CD31和Ki67的雙重免疫熒光染色檢測內皮細胞增殖，以每個視野中CD31陽性血管數(shù)代表血管密度。用CD31/Fn,CD31/ɑ5和CD31/β3雙重免疫熒光染色確定Fn，α5β1和αVβ3在血管上的表達。結果缺血第7 d時老齡鼠半暗帶區(qū)CD31/Ki67雙陽性細胞數(shù)顯著低于青年鼠（4.7±0.8/field,P＜0.05）；缺血7 d和14 d時老齡鼠半暗帶區(qū)血管密度均比青年鼠顯著降低（38.3±3.9/field,45±4.4/field,均P＜0.01）。同時，青年和老齡鼠腦缺血7 d后半暗帶區(qū)血管上Fn，α5和β3整合素的表達較之于對照組均呈不同程度平行上調，而14 d時則趨于下降。而較之于青年鼠，老齡鼠缺血7 d后半暗帶區(qū)Fn/α5/β3陽性血管數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結論老齡小鼠腦缺血后血管新生缺陷可能與血管上Fn及其受體α5β1、αVβ3表達上調不足有關。

腦缺血再灌注 血管新生 整合素 衰老

腦缺血后微血管新生的范圍和程度關系到半暗帶血流改善，影響著神經(jīng)元功能恢復，也決定著預后，有證據(jù)表明微血管密度與腦梗死患者的生存時間存在正相關[1]。近期我們發(fā)現(xiàn)腦缺血或缺氧誘導明顯血管新生反應的同時，纖維連接蛋白（fibronection,Fn）及其受體整合素α5β1和αVβ3在新生血管上表達顯著增加，并發(fā)現(xiàn)Fn通過受體α5β1和αVβ3在腦內血管新生中起重要調節(jié)作用[2-4]。臨床和實驗證據(jù)均顯示[5]，老化與腦梗死體積及卒中后腦功能的恢復呈負相關。尚有研究顯示，老化的卒中動物腦內出芽式血管新生反應受損[6]。于此，我們觀察了老齡小鼠腦缺血后血管新生缺陷與其血管上Fn及其受體ɑ5β1和ɑVβ3表達的關聯(lián)性，為闡明老年性卒中血管新生缺陷機制和潛在的治療手段提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SPF級C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物房，恒溫21℃，層流架中分籠飼養(yǎng)，24 h周期明暗交替照明，動物自由進食及飲水。選取2月齡（青年）、18月齡（老齡）雄性小鼠為觀察對象。每個年齡段分為假手術（對照，sham）組、腦缺血組。于模型成功后7 d，14 d行免疫熒光染色，各年齡段假手術組和缺血后不同時間點各5只。本研究獲得我院動物管理與倫理委員會同意。

1.2 小鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）腦缺血模型制備選取C57BL/6小鼠，參照Li[7]和肖晗等[8]的方法制備MCAO腦缺血模型。術后行神經(jīng)功能缺損評分，將評分≥3分小鼠歸入實驗組。小鼠短暫性缺血90min后，于顯微鏡下將線栓拔出后隨機分成再灌注后7 d、14 d組，每組5只。假手術小鼠（n=5）進行相似的手術，但不插線栓栓塞大腦中動脈。

1.3 組織的準備麻醉下經(jīng)左心室升主動脈快速灌注灌流4℃生理鹽水后快速將腦組織分離，OCT包埋后放置于-80℃冰箱保存。在Leica恒冷箱切片機內制作全腦冷凍標本冠狀連續(xù)切片（貼片法），片厚10μm，收集全部切片保存在-80℃冰箱中備用。

1.4 免疫熒光染色免疫熒光染色(immunofluorescentstaning,IF)采取貼片法,按凌莉[9]和我們報道[2]方法進行。切片復溫20min，入預冷的1:1丙酮/甲醇中固定3min，PBS充分漂洗后，滴加2%血清室溫孵育1 h封閉無關抗原，切片入一抗4℃孵育24 h，PBS充分漂洗后，入標記有熒光染料的二抗中室溫孵育1 h。陰性對照以PBS代替一抗。對于雙重染色，重復上述步驟，但一抗來源于不同種屬,對應二抗用不同熒光染料標記。一抗包括：單克隆FITC標記的大鼠抗小鼠CD31(BD)，PE標記的大鼠抗小鼠α5(BD),PE標記的倉鼠抗小鼠β3 (BD)，倉鼠抗小鼠CD31(Abcam)，多克隆兔抗fibronectin(Sigma)，多克隆兔抗ki67(Abcam)；二抗：AlexaFluor 488標記的羊抗大鼠和羊抗兔，Cy3標記的羊抗大鼠和羊抗兔購于EarthOx，AlexaFluor 488和Cy3標記的羊抗倉鼠購于Jackson Immunoresearch(WestGrove,PA)。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0行t檢驗分析，采用Leica TCSSP5Ⅱ激光掃描共聚焦顯微鏡，每組（n=5）切片分別選取2個不同區(qū)域（缺血核心區(qū)、半暗帶區(qū)）拍攝照片，每個區(qū)域分別隨機選取3個視野（×40）（取均值），肉眼分別統(tǒng)計每組標本的不同陽性結果數(shù)量。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 青老齡小鼠腦缺血后內皮細胞增殖反應和血管密度變化以內皮細胞特異性標記物CD31和細胞增殖特異性標記物Ki67來檢測內皮細胞增殖情況，通過統(tǒng)計每個視野中CD31陽性血管的數(shù)量來確定血管的密度。

如圖1A所示，青年和老齡鼠假手術組均未發(fā)現(xiàn)內皮細胞增殖，但缺血再灌注后7 d，青年和老齡鼠缺血半暗帶區(qū)均有不同程度內皮細胞增殖，而至14 d時內皮增殖均明顯下降。定量統(tǒng)計顯示（圖1B），每個視野中老齡鼠缺血半暗帶區(qū)CD31/Ki67雙陽性細胞數(shù)在7 d時顯著低于青年組，P＜0.05；再灌注后7 d，青年和老齡鼠缺血核心區(qū)內時偶有內皮細胞增殖，而在14 d時均無內皮細胞增殖（圖1A-B）。

如圖1C所示，青老齡鼠腦缺血半暗帶區(qū)血管密度在缺血后7 d時均較各自對照組增加，在14 d時則較前進一步增加。但老齡鼠缺血14 d時半暗帶區(qū)血管密度顯著低于青年鼠（P＜0.01），甚至早在7 d時其密度亦低于青年鼠（P＜0.01）。

缺血7 d后，青年和老齡鼠缺血核心區(qū)血管密度均較各自對照組明顯下降，14 d后雖有略微增加，但仍處于較低水平（圖1C），這表明在缺血核心區(qū)青年和老齡鼠均發(fā)生明顯血管退變。

2.2 青老齡小鼠腦缺血后Fn及其受體整合素α5β 1和αVβ3在血管上的表達差異通過雙重IF對比觀察了青老齡鼠腦缺血再灌注7 d和14 d后腦內血管上Fn及其受體整合素α5β1和αVβ3表達的變化。

如圖2-4A所示，青老齡鼠對照組腦內皮細胞上僅表達低水平Fn和α5，幾無β3表達，而腦缺血后7 d，青年和老齡鼠缺血半暗帶區(qū)血管上Fn，α5和β3表達均呈不同程度平行上調，但14 d時又明顯下降。

定量統(tǒng)計顯示，每個視野中青年鼠缺血7 d后半暗帶區(qū)Fn陽性血管數(shù)（圖2B）/α5陽性血管數(shù)（圖3B）/β3陽性血管數(shù)（圖4B）均顯著高于各自對照組（均P＜0.001）和缺血7d后的老齡鼠（均P＜0.05）。

3 討論

圖1 腦缺血后內皮細胞增殖反應和血管密度變化A：CD31（綠色）和Ki67（紅色）雙重IF檢測內皮細胞增殖，n=5，標尺=100 um。B和C分別為CD31/Ki67雙陽性細胞和CD31陽性細胞定量統(tǒng)計分析圖。所有結果以均數(shù)±標準誤表示。與對照（sham）組比較，#P＜0.01,##P＜0.001；與老齡鼠（18 m）比較，*P＜0.05, **P＜0.01

圖2 腦缺血后半暗帶區(qū)Fn在腦血管上的表達變化A：CD31(綠色)和Fn(紅色)的雙重IF來檢測血管上Fn表達，n=5，標尺=100 um。B為Fn陽性血管數(shù)量的定量統(tǒng)計分析圖。所有結果以均數(shù)±標準誤表示。與對照（sham）組比較，##P＜0.001；與老齡鼠（18m）比較，*P＜0.05

圖3 腦缺血后半暗帶區(qū)ɑ5整合素在腦血管上的表達變化A：CD31(綠色)和ɑ5（紅色)的雙重IF來檢測血管上ɑ5整合素表達，n=5，標尺=100um。B為ɑ5陽性血管數(shù)量的定量統(tǒng)計分析圖。所有結果以均數(shù)±標準誤表示。與對照（sham）組比較，##P＜0.001；與老齡鼠（18m）比較，*P＜0.05

圖4 腦缺血后半暗帶區(qū)β3整合素在腦血管上的表達變化A：CD31(綠色)和β3(紅色)的雙重IF來檢測血管上β3整合素表達，n=5，標尺=100um(A)。B為β3陽性血管數(shù)量的定量統(tǒng)計分析圖。所有結果以均數(shù)±標準誤表示。與對照（sham）組比較，##P＜0.001；與老齡鼠（18m）比較，*P＜0.05

高齡患者卒中后預后較差[10]，這與其卒中后新血管生成較少有關[11]。本實驗研究中，我們對比觀察了青老齡小鼠腦缺血后7 d和14 d內皮細胞增殖反應和血管密度變化，發(fā)現(xiàn)腦缺血誘導青年和老齡鼠腦內均出現(xiàn)了不同程度血管新生。但老齡鼠缺血半暗帶區(qū)CD31/Ki67雙陽性細胞數(shù)在7 d時顯著低于青年組，而且老齡鼠缺血14 d時半暗帶區(qū)血管密度顯著低于青年鼠，甚至早在7 d時其密度亦低于青年鼠，這提示老齡鼠腦缺血后血管新生能力缺陷。我們的結果與Buga等[6]報道一致，但新近Manwani等[5]用抗CD31的免疫組化染色比較觀察了青年和老齡鼠缺血側腦內微血管密度變化，卻未發(fā)現(xiàn)兩組間存在變化，其原因在于Manwani僅觀察了卒中后24 h時兩組間變化，并未觀察后續(xù)變化，而就我們的觀察（未發(fā)表資料），成年鼠腦缺血后24 h內皮細胞的增殖才開始增殖，7 d達高峰，這解釋了青老齡小鼠在缺血早期腦內血管密度無差異變化的原因。

我們先前用Cre-Lox基因敲除技術剔除內皮細胞上α5基因建立了內皮細胞特異性α5敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠缺氧后內皮細胞增殖反應延遲，腦內血管新生反應減弱，毛細血管密度降低，并伴有Fn在內皮細胞上沉積減少[4]。這證實Fn通過受體整合素α5β1在缺氧后腦內血管新生中起關鍵調節(jié)作用。為了探討老齡鼠腦缺血后腦內血管上Fn及其受體整合素的表達與其腦內血管新生缺陷間的聯(lián)系，本研究中，我們對比觀察了老齡和青年小鼠腦缺血再灌注7 d和14 d后腦內血管上Fn及其受體整合素α5β1和αVβ3表達的變化，發(fā)現(xiàn)在腦缺血后7 d，青年和老齡鼠缺血半暗帶區(qū)血管上Fn，α5和β3的表達均呈不同程度平行上調，但14 d時又明顯下降。我們注意到，老齡鼠缺血7 d時半暗帶區(qū)Fn/α5/β3陽性血管數(shù)均顯著低于青年鼠，而至14 d，老齡和青年鼠腦內Fn/α5/β3陽性血管數(shù)則無明顯差異。有意義的是，老齡鼠腦缺血后內皮細胞的增殖在缺血7d時也顯著落后于青年鼠，而至14 d，青老齡鼠腦內皮細胞增殖均明顯下降且無顯著性差異，這種時相表達上的巧合極力提示Fn-α5β1/αVβ3在血管上表達上調不足很可能是老齡小鼠腦缺血后腦內血管新生反應缺陷的重要原因。

鑒于Fn-α5β1/αVβ3的促血管新生作用，特別是α5β1在缺氧后腦內血管新生中的關鍵調節(jié)作用，考慮到老齡鼠缺血后腦內血管上整合素α5β1 /αVβ3上調不足，那么人為增加血管上α5β1/αVβ 3表達，可能有助于老齡卒中患者腦內血管新生，并最終促進其神經(jīng)功能的改善，這需要進一步試驗的作證。

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The relationship between the expression patterns of fibronectin and its recep tors-α5β1 and αVβ3 integrins and the defect of angiogenesis after cerebral ischemia in aged mice.

HUANG Heng,HUANG Qijuan,WANG Fuxin,LI Longxuan.
Departments of Neurology,Guangdong Medical College Affiliated Hospital,Zhanjiang 524001，China.Tel:021-58858730.

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression patterns of fibronectin(Fn)and its receptors-α5β1 andαVβ3 integrins and angiogenesis after cerebral ischemia in aged mice.MethodsBoth young(2 months)and aged(18months)C57BL6malemicewere subject tomiddle cerebral artery occlusion.The brain endothelial cells(BECs)proliferation was assessed by using dual-immunofluorescent staning(IF)for Ki67 and CD31 and the vessel density was quantified by counting the number of CD31-positive vessels per field of view.The expression patterns of Fn, α5β1 andαVβ3 on blood vessels was assessed by using dual-IF for CD31/ɑ5，CD31/β3 and CD31/Fn.ResultsThe number of CD31/Ki67 dual-positive cells in the penumbra at day 7 after cerebral ischemia of was significantly lower in the agedmice than in the youngmice(4.7±0.8/field,P＜0.05).The number of CD31-positive vessels in the penumbraatday 7 and 14 ofwas both significantly lower in aged mice than in the youngmice(38.3±3.9/field,45±4.4/field,both P＜0.01).Furthermore,the expression of Fn,α5 andβ3 on blood vessels in the penumbra at day 7 after cerebral ischemia was significantly lower in agemice than in the youngmice(P＜0.05).ConclusionsThe cerebral angiogenesis after cerebral ischemia is impaired in the aged stroked mice,which is associated with the lowexpression of fibronectin and its receptors-α5β1 andαVβ3 integrinson blood vessels.

Cerebralischemia-reperfusion Angiogenesis Integrin Aging

R743.3

A

2014-08-20）

（責任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.11.004

☆ 國家自然科學基金面上項目（編號：81171244）；廣東省自然科學基金項目（編號：S2011010004095）；廣東省醫(yī)學科研基金項目（編號：A2011440）；第44批教育部留學人員回國啟動基金項目（編號：教外司留［2012］940號）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學科建設資助（編號：PWZx2014-08）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領先人才培養(yǎng)計劃（編號：PWR12014-05）

* 廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)科（湛江524001）

△ 廣東省江門市臺山人民醫(yī)院神經(jīng)科

※ 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院神經(jīng)科