高效液相色譜法內(nèi)標(biāo)法測(cè)定鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片的含量*

鄭露露 ，曾 媛 ，劉 輝 ，段 婷

（1.中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430070； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065）

鹽酸苯環(huán)壬酯（phencynonate hydrochloride）化學(xué)名為苯基環(huán)戊基羥基乙酸[N －甲基 －3－氮雜雙環(huán)(3，3，1)壬]－9α－酯鹽酸鹽[1]，是我國研制的新一代高選擇性中樞抗膽堿能抗暈動(dòng)?、耦愋滤嶽2]，其藥效強(qiáng)，但中樞抑制作用弱[3]，是一種高效、安全的抗暈動(dòng)病藥物?，F(xiàn)已有鹽酸苯環(huán)壬酯片（商品名飛賽樂）上市銷售，但其半衰期較短（t1/2為 3～4 h）[4]，預(yù)防暈動(dòng)病時(shí)需多次給藥，易使血藥濃度產(chǎn)生峰谷波動(dòng)；在長(zhǎng)程用藥時(shí)，可導(dǎo)致嗜睡、視物模糊等不良反應(yīng)。為避免普通片的缺點(diǎn)，筆者采用雙層滲透泵技術(shù)對(duì)現(xiàn)有鹽酸苯環(huán)壬酯片進(jìn)行制劑創(chuàng)新，制備了長(zhǎng)效、低毒、日服1次的鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片，特別適用于海上作業(yè)或長(zhǎng)途乘船、乘車的暈動(dòng)病患者。鹽酸苯環(huán)壬酯制劑的含量測(cè)定已有高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法[5－7]和溶劑萃取酸性色素比色法[8－9]報(bào)道，由于本研究中制備的鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片樣品前處理較復(fù)雜，對(duì)含量測(cè)定有較大的影響，采用現(xiàn)有方法均無法準(zhǔn)確進(jìn)行該制劑的質(zhì)量控制。筆者通過選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，建立了HPLC－內(nèi)標(biāo)法測(cè)定該制劑中鹽酸苯環(huán)壬酯的含量。與現(xiàn)有測(cè)定方法相比，該方法通過加入內(nèi)標(biāo)物，可以校準(zhǔn)和消除由于操作條件波動(dòng)或制劑中組分和制備流程重現(xiàn)性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[10]，提高了分析的準(zhǔn)確性和精密度。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（DG230－4在線脫氣機(jī)，G1310A IsoPump，LGC－1025M柱溫箱；G1329A ALS，G1314B VWD，Agilent HP Chemsatation工作站）；BT25S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ－250E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。鹽酸苯環(huán)壬酯（北京華素制藥股份有限公司，批號(hào)為1210251）；鹽酸苯環(huán)壬酯對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100716－200501）；鹽酸地芬尼多對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100841－201303）；氫溴酸樟柳堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100399－200601）；鹽酸戊乙奎醚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100931－201101）；硫酸阿托品（杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為030809）；硝酸毛果蕓香堿（廣東省醫(yī)藥保健品進(jìn)出口公司，批號(hào)為1007133）；鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片（自制，規(guī)格為每片4 mg）；乙腈（Merck KGaA，色譜純），其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈 －水 －磷酸 －三乙胺(270∶400∶1.3∶2)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速：1.0 mL /min；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按鹽酸苯環(huán)壬酯峰計(jì)算不低于2 000。

2.2 溶液制備

內(nèi)標(biāo)液：精密稱取鹽酸地芬尼多適量，加流動(dòng)相配制成0.2 g/L內(nèi)標(biāo)貯備液；精密量取該貯備液1 mL，置 10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得20 μg/mL鹽酸地芬尼多內(nèi)標(biāo)液。分別精密稱取硫酸阿托品、氫溴酸樟柳堿、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚對(duì)照品適量，各加流動(dòng)相溶解并定量稀釋，分別配制成5μg/mL的硫酸阿托品、氫溴酸樟柳堿、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚，作為內(nèi)標(biāo)液。

供試品溶液：取自制鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片20片，去除衣膜后，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量細(xì)粉（約相當(dāng)于鹽酸苯環(huán)壬酯4 mg），置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量，室溫溶脹2 h后，精密量取內(nèi)標(biāo)貯備液10 mL，超聲處理30 min使鹽酸苯環(huán)壬酯溶解，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液：精密稱取鹽酸苯環(huán)壬酯對(duì)照品適量，加流動(dòng)相配制成0.4 g/L的對(duì)照品貯備液，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得4 μg/mL的對(duì)照品溶液。

校正因子溶液：分別精密量取0.4 g/L對(duì)照品貯備液和0.2 g/L內(nèi)標(biāo)貯備液各1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按處方分別制備鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片和不含鹽酸苯環(huán)壬酯的空白片，分別按2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定；另取2.2項(xiàng)下鹽酸苯環(huán)壬酯對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在擬訂的色譜條件下，其他成分不干擾鹽酸苯環(huán)壬酯的測(cè)定。

2.4 內(nèi)標(biāo)物選擇

先后考察了以硫酸阿托品、氫溴酸樟柳堿、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚、鹽酸地芬尼多等與鹽酸苯環(huán)壬酯分子量接近的、分子結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2.1項(xiàng)色譜條件下，硫酸阿托品 (t＝ 2.2 min)、氫溴酸樟柳堿 (t＝ 2.0 min)和硝酸毛果蕓香堿(t＝1.7 min)均在輔料峰處出峰，鹽酸戊乙奎醚(t＝4.1 min)出現(xiàn)雙峰，均無法作為內(nèi)標(biāo)物；而鹽酸地芬尼多的保留時(shí)間(t＝3.9 min)，峰形良好，可與鹽酸苯環(huán)壬酯(t＝7.6 min)實(shí)現(xiàn)完全分離(分離度≥10)，且 9 min內(nèi)即可完成檢測(cè)。色譜圖見圖1。因此，最終選擇鹽酸地芬尼多作為內(nèi)標(biāo)物。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密稱取鹽酸苯環(huán)壬酯對(duì)照品5 mg，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量，振搖使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得 50 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密量取該對(duì)照品溶液 2，3，4，5，6.0 mL，分別置 50 mL容量瓶中，各精密加入 2.2項(xiàng)下鹽酸地芬尼多內(nèi)標(biāo)液5 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按上述的色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，重復(fù)3次，取平均值。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.175 1 X ＋0.027 6，r＝0.999 2。結(jié)果表明，鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度在2～6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取 2.2項(xiàng)下校正因子溶液及供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，于 0，4，8，12，24 h 分別測(cè)定校正因子溶液和供試品溶液的峰面積。結(jié)果供試品溶液和校正因子溶液中鹽酸苯環(huán)壬酯與內(nèi)標(biāo)物的平均峰面積比分別為0.82和0.71，RSD分別為 1.90% 和 1.08% （n ＝3）。

精密度試驗(yàn)：精密量取線性關(guān)系考察項(xiàng)下50 μg/mL的對(duì)照品溶液 3.2，4.0，4.8 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，各精密加入2.2項(xiàng)下 20 μg/mL鹽酸地芬尼多內(nèi)標(biāo)液5 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按擬訂的色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，重復(fù)2次。結(jié)果低、中、高3種不同濃度溶液的平均校正因子分別為0.59，0.72，0.87，RSD 分別為 1.21% ，0% ，0.82% （n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片(批號(hào)為20140312)20片，去除衣膜后，精密稱定，研細(xì)，分別精密稱取6份細(xì)粉樣品（約相當(dāng)于鹽酸苯環(huán)壬酯4 mg），按2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果樣品平均標(biāo)示量為 98.8%，RSD為1.40%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

中間精密度試驗(yàn)：由甲、乙、丙3人按重復(fù)性試驗(yàn)方法，各精密稱取3份細(xì)粉樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸苯環(huán)壬酯4 mg），照2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果樣品中鹽酸苯環(huán)壬酯的標(biāo)示量分別為98.4%，99.9%，100.1%，RSD 分別為 1.12% ，0.62% ，0.12% （n ＝3），表明方法復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取100 mg鹽酸苯環(huán)壬酯對(duì)照品，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量，溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得1 g/L 的鹽酸苯環(huán)壬酯溶液。精密量取該溶液 3.2，4.0，4.8 mL 各3份置100 mL容量瓶中，分別加入處方量的輔料后，加流動(dòng)相適量，室溫溶脹2 h后，然后精密移取2.2項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)貯備液10 mL并加入，超聲處理30 min，使鹽酸苯環(huán)壬酯溶解，放冷，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得低、中、高濃度的供試品溶液各3份。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸苯環(huán)壬酯的平均回收率為101.3%，RSD 為 1.63%（n＝9），符合檢測(cè)要求。

2.6 樣品含量測(cè)定

取不同批次的鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片，按2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按 2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積；同法測(cè)定校正因子溶液，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比值計(jì)算含量。結(jié)果見表 1，3個(gè)批次樣品的含量均符合規(guī)定。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

本研究所制備的鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片處方中，含有大量的聚氧乙烯、羥丙甲纖維素等高分子材料，這些高分子材料遇水后，經(jīng)水合作用發(fā)生膨脹，呈黏稠的凝膠狀態(tài)。為了使鹽酸苯環(huán)壬酯完全溶解，并防止樣品堵塞色譜柱和HPLC測(cè)定系統(tǒng)，需經(jīng)溶脹、超聲、濾膜過濾等多步處理，易引起樣品損失，從而導(dǎo)致回收率下降。采用常規(guī)的外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度無法達(dá)到要求。本研究所建立的HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片中主藥含量，以鹽酸地芬尼多為內(nèi)標(biāo)物，消除了樣品處理的煩瑣操作對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來的影響，準(zhǔn)確性、專屬性強(qiáng)，可用于新藥鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

HPLC內(nèi)標(biāo)法選擇內(nèi)標(biāo)物時(shí)，要求內(nèi)標(biāo)物是供試品中不存在的純物質(zhì)，且內(nèi)標(biāo)物的色譜峰應(yīng)位于待測(cè)組分色譜峰附近，并與待測(cè)組分完全分離。而且，應(yīng)注意內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)組分的物理及物理化學(xué)性質(zhì)（如揮發(fā)度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性以及溶解度等）相近，這樣即使操作條件變化時(shí)，更有利于內(nèi)標(biāo)物及待測(cè)組分作均勻的變化。本研究中探索了硫酸阿托品、氫溴酸樟柳堿、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚及鹽酸地芬尼多等5種與鹽酸苯環(huán)壬酯分子量接近的、分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)候選物，結(jié)果表明鹽酸地芬尼多最理想，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子）均符合要求，故最終確定以鹽酸地芬尼多為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)建立了鹽酸苯環(huán)壬酯控釋片的含量測(cè)定方法。

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