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    基于酶活性調(diào)節(jié)的釀酒酵母谷胱甘肽發(fā)酵調(diào)控研究

    2014-04-24 13:22:46方聰明劉聯(lián)杰周安盛林建國
    中國釀造 2014年6期
    關(guān)鍵詞:谷氨胞內(nèi)谷胱甘肽

    方聰明,劉聯(lián)杰,周安盛,杜 馨,林建國,蔡 俊*

    (湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430068)

    谷胱甘肽(glutathione,GSH)是生物體中廣泛存在的非蛋白質(zhì)巰基類三肽化合物,作為一種特殊的肽類,其在真核細(xì)胞中占主要地位[1]。GSH在很多的生化過程中起作用,它具有抗氧化、解毒、參與蛋白質(zhì)修飾及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能,這些生理活性作用使其在醫(yī)藥、食品及美容等行業(yè)有著很大的應(yīng)用價值及潛力[2]。在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽經(jīng)兩步酶催化反應(yīng)而生成,其中第一步反應(yīng)中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS,EC 6.3.2.2)由GSH1基因編碼合成,并且γ-GCS的活性受GSH的反饋抑制[3-4]。目前生產(chǎn)GSH的主要方法為微生物發(fā)酵法,主要利用釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母來生物合成[5]。提高酵母細(xì)胞內(nèi)GSH的含量及細(xì)胞的生物量是研究中兩個主要的指標(biāo)。生物量的提高是通過高密度發(fā)酵來實(shí)現(xiàn),補(bǔ)料分批發(fā)酵是進(jìn)行高密度發(fā)酵重要手段,而胞內(nèi)的GSH含量的提高需首先選育高產(chǎn)GSH的菌種[6-7],再通過生理環(huán)境調(diào)節(jié)來提高。為了提高這兩個指標(biāo),很多文獻(xiàn)報道研究了發(fā)酵培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分[8-11]、發(fā)酵方式[12-13]、前體物質(zhì)的補(bǔ)加[14-15]和生理環(huán)境脅迫[16]等,但GSH產(chǎn)量仍不高,發(fā)酵成本較高,無法工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)在研究了GSH合成關(guān)鍵酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特征的基礎(chǔ)上,對補(bǔ)料分批發(fā)酵中pH控制和溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,來提高釀酒酵母發(fā)酵中GSH的產(chǎn)量。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    高產(chǎn)谷胱甘肽釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCCCG:發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

    由本實(shí)驗(yàn)室通過含GSH1基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌誘導(dǎo)表達(dá)并分離純化而制得。具體方法:將大腸桿菌工程菌E.coliBL21(pGEX-GSH1)在LB培養(yǎng)基中經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng),收集菌體,超聲波破碎,離心取上清液,過GST-Resin柱,并在層析柱上切除谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-tranferase,GST)標(biāo)簽,最后獲得GSH1重組蛋白,-20 ℃保存。

    1.1.3 主要試劑

    GSH(分析純)、庚烷磺酸鈉(分析純)、三磷酸腺苷酸鈉(分析純):美國Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純):美國Amresco公司;預(yù)裝1mL GST-Resin 重力柱:上海生工生物工程公司;其他試劑均為分析純并購于上海國藥集團(tuán)。

    1.1.4 培養(yǎng)基

    大腸桿菌培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,固體培養(yǎng)基加入20 g/L 瓊脂,pH 7.0 左右,121 ℃下滅菌20 min。

    釀酒酵母菌種斜面活化培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母提取物10 g/L,20 g/L瓊脂,pH 6.0左右,115 ℃下滅菌30 min。

    一級、二級種子液培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母提取物10 g/L,20 g/L瓊脂,pH 6.0,115 ℃下滅菌30 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉100 g溶于9 L水(成分A);糖蜜(含可發(fā)酵性糖28%)8 L(成分B);葡萄糖840 g 溶于3 L 水中(成分C);(NH4)2SO4264 g、NH4H2PO435 g 溶于700 mL水中(成分D),所有各成分121 ℃條件下滅菌20 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    30 L Biostat C plus發(fā)酵罐:德國貝朗(B.Braun)公司;LC-20AD HPLC系統(tǒng):日本島津(Shimadzu)公司;Inertsi ODS-SP色譜柱:島津技邇公司(GL sciences)。

    1.3 方法

    1.3.1γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的測定[17]

    在1 mL體系中進(jìn)行γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的測定,緩沖液體系100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),體系中含有20 mmol/L谷氨酸鈉、10 mmol/L L-半胱氨酸、5 mmol/L三磷酸腺苷酸二鈉、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2及適量的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,將反應(yīng)體系置于37 ℃水浴振蕩處理30 min,最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸0.1 mL終止反應(yīng),并離心處理。取離心后的上清液利用磷鉬藍(lán)法測定反應(yīng)過程中產(chǎn)生的無機(jī)磷量。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活定義:在一定條件下,單位體積(mL)酶液在單位時間(h)內(nèi)催化生成1 μmol無機(jī)磷的量為一個酶活單位(U)。

    1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶學(xué)特性的分析

    根據(jù)酶活的測定方法,改變緩沖液體系的反應(yīng)pH(其變化從6.0至11.0),研究pH對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響。同樣改變緩沖液體系的反應(yīng)溫度(其變化從25 ℃到45 ℃),研究溫度對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響。

    1.3.3 菌種活化及種子液培養(yǎng)條件

    固體斜面試管30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。一級種子液:用接種環(huán)取一環(huán)已活化好的菌種接入25 mL種子培養(yǎng)基250 mL三角揺瓶中,30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h。二級種子液:用移液槍吸取10 mL 新鮮的一級種子培養(yǎng)液接入裝有100 mL種子液的1 000 mL三角瓶中,30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。

    1.3.4 發(fā)酵罐流加發(fā)酵的控制

    發(fā)酵開始發(fā)酵罐中只有發(fā)酵培養(yǎng)基成分A,經(jīng)過滅菌后培養(yǎng)基體積約為10 L,按10%的接種量接入培養(yǎng)好的二級種子,發(fā)酵過程中采用分階段控制策略,發(fā)酵前期流加糖蜜(成分B),當(dāng)菌體濕質(zhì)量達(dá)到150 g/L左右時,開始流加葡萄糖(成分C)至菌體濕質(zhì)量達(dá)到210 g/L 左右時,同時整個過程中一開始就流加氮源(成分D)至加完為止。在這個過程中通過控制轉(zhuǎn)速、通氣量、碳源和氮源的流加速度來控制酒精的含量(0.1%vol~0.5%vol)和溶氧量,同時通過酒精的含量來反饋調(diào)節(jié)碳源的流加速度。發(fā)酵過程中的pH用10%稀硫酸和10%的碳酸鈉來調(diào)節(jié)。

    1.3.5 細(xì)胞生物量測定

    取一定體積發(fā)酵液5 000 r/min,離心10 min,用去離子水洗滌2次并收集菌體,置于105 ℃烘干至質(zhì)量恒定,精確稱質(zhì)量,減去離心管干質(zhì)量即得到酵母的菌體干質(zhì)量(dry cell weight,DCW)。

    1.3.6 發(fā)酵液中酒精含量的測定

    采用馬丁儀微量測定法[18]:準(zhǔn)確移取0.05 mol/L酸性重鉻酸鉀溶液10.0 mL 于球形接收器中,移取10.0 mL 0.06 g/L氫氧化鈉溶液倒入隔離管中并加入1.0 mL發(fā)酵液,接好儀器加熱蒸餾,以沸騰時開始記時,蒸餾5 min。停止后用少量蒸餾水沖洗連接管口,取下接收器迅速冷卻至室溫,將接收器中的液體全部收集到250 mL三角瓶中,加入2 mL碘化鉀溶液及1 mL淀粉指示液,用1.0 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至綠色為終點(diǎn)。

    式中:X為乙醇含量,%vol;C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;V1為空白試驗(yàn)消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液量,mL;V2為試樣消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液量,mL;V3為加入馬丁儀中的樣品體積,mL;N 稀釋倍數(shù);常數(shù)0.014 6為1.00 mL 1.0 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于乙醇的量。

    1.3.7 谷胱甘肽的提取

    取一定量的濕菌體于離心管中,加入適當(dāng)?shù)膒H=3.0鹽酸溶液,充分振蕩至菌體細(xì)胞分散均勻并放置冰上處理5 min,再將其放在95~100 ℃下水浴5 min,然后迅速在冰上冷卻,再取部分懸液12 000 r/min離心2 min,取離心后的上清液進(jìn)行GSH的檢測。

    1.3.8 谷胱甘肽的液相色譜檢測

    采用LC-20AD液相色譜(HPLC)系統(tǒng)進(jìn)行檢測操作。色譜柱:Inertsi ODS-SP(150 mm×4.6 mm×5 μm);流動相:磷酸緩沖液與甲醇95∶5(V/V),其中磷酸鹽緩沖液為50 mmol/L KH2PO4溶液,內(nèi)含10 mmol/L庚烷磺酸鈉,并用磷酸將緩沖液pH值調(diào)至3.0;檢測波長:210 nm;UV檢測器SPD-20A;流速1.0 mL/min;上樣量20 μL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH和溫度對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活性的影響

    圖1 pH(A)和溫度(B)對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影響Fig.1 Effect of pH (A) and temperature (B) on the activity of γ-GCS

    對γ-GCS進(jìn)行酶活分析,得到的結(jié)果如圖1所示。由圖1A可知,γ-GCS催化反應(yīng)的最適pH為8.5左右,在pH 6.5~8.5的范圍內(nèi)增幅很大。由圖1B可知,溫度對于γ-GCS的影響是明顯的,在25~35 ℃其酶活性逐漸增高,其酶活最適溫度為35 ℃左右。

    2.2 谷胱甘肽的液相色譜檢測

    GSH標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測結(jié)果如圖2所示,釀酒酵母CCCG細(xì)胞提取的上清液HPLC檢測結(jié)果如圖3所示。

    圖2 GSH標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測結(jié)果Fig.2 HPLC result of standard GSH

    圖3 釀酒酵母CCCG細(xì)胞提取的上清液HPLC檢測結(jié)果Fig.3 HPLC result of the extract supernatant of Saccharomyces cerevisiae CCCG

    由圖2可知,標(biāo)準(zhǔn)GSH在HPLC檢測下的保留時間為4.6 min。由圖3可知,在4.6 min左右有明顯的峰,與左右雜峰有很好的分離度,可以確定圖3中10號峰為GSH特征峰,實(shí)驗(yàn)中所用HLPC方法可以檢測出樣酵母細(xì)胞抽提液中的GSH含量。

    2.3 初始發(fā)酵條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖4 初始發(fā)酵條件下各控制參數(shù)的變化曲線Fig.4 Curve of all fermentation parameters in initial condition

    圖5 初始發(fā)酵條件下菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變化曲線Fig.5 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield in initial condition

    在初始條件下進(jìn)行發(fā)酵,其過程中的各參數(shù)控制如圖4所示。由圖4可知,發(fā)酵溫度控制在30 ℃恒定不變,其他參數(shù)可調(diào)節(jié),發(fā)酵后期pH控制在4.5左右。整個過程中乙醇含量和溶氧量是限制性條件,控制發(fā)酵液中的乙醇含量在0.1%vol~0.5%vol范圍內(nèi),溶氧量下降到最低點(diǎn)后調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)至其在5%左右。對于碳源的流加,先流加糖蜜,再加葡萄糖。氮源的流加過程發(fā)酵一開始就進(jìn)行至其加完??刂妻D(zhuǎn)速、通氣量來調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的乙醇含量及溶氧。結(jié)果表明,在8~24 h內(nèi)是各參數(shù)變化最大的時間,這一階段為菌體對數(shù)生長期,代謝旺盛。

    圖5為初始發(fā)酵條件下菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變情況。由圖5可知,菌體生物量(干質(zhì)量)在36 h達(dá)到最大,36~48 h內(nèi)變化很小。而胞內(nèi)GSH含量在42 h后才至達(dá)最大值,同時GSH產(chǎn)量也在這時候達(dá)到最高。發(fā)酵結(jié)束時,菌體生物量達(dá)到(40.70±1.31)g/L,胞內(nèi)GSH含量為(19.10±0.36)mg/g,GSH產(chǎn)量為(777.37±18.57)mg/L。

    2.4 在初始條件基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵pH調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖6 pH調(diào)節(jié)下各控制參數(shù)的變化曲線Fig.6 Curve of all fermentation parameters under pH control

    圖7 pH調(diào)節(jié)下菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變化曲線Fig.7 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under pH control

    發(fā)酵過程中溫度、溶氧及發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在初始條件的范圍內(nèi),進(jìn)行發(fā)酵pH調(diào)節(jié),發(fā)酵過程中各參數(shù)變化見圖6所示。由圖6可知,結(jié)合酶的最適pH值為8.0及其酶活在pH 6.5~8.5的范圍內(nèi)增幅很大,同時也考慮到釀酒酵母生長適合的pH 范圍在4.0~6.0之間,發(fā)酵過程中0~24 h 內(nèi)pH 維持在5.5~6.5之間,并在16~24 h逐漸調(diào)節(jié)到6.5左右,pH的調(diào)節(jié)可以通過流加堿液、碳源/氮源流加速度等來調(diào)節(jié)。圖7為發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變情況。由圖7可知,菌體生物量(干質(zhì)量)在38 h達(dá)到最大,38~48 h內(nèi)變化很小。而胞內(nèi)GSH含量在36 h就達(dá)到最大值,同時GSH產(chǎn)量也在這時候達(dá)到最高。發(fā)酵結(jié)束時,菌體生物量達(dá)到(44.80±1.20)g/L,胞內(nèi)GSH含量為(19.74±0.51)mg/g,GSH產(chǎn)量為(884.35±27.30)mg/L。與初始條件相比較,胞內(nèi)GSH含量有些增高但變化不大,提高了3.35%,但GSH生物量及胞內(nèi)GSH含量到達(dá)最大值的時間大大縮短,生物量增高了10.07%,最終GSH產(chǎn)量增高了13.76%。

    2.5 在初始條件基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖8 溫度調(diào)節(jié)下各控制參數(shù)的變化曲線Fig.8 Curve of all fermentation parameters under temperature control

    在初始條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn),其他參數(shù)pH值、發(fā)酵液中乙醇含量、溶氧控制在初始條件的范圍內(nèi),整個過程通過調(diào)節(jié)碳源/氮源的流加速度、通氣量、轉(zhuǎn)速等來維持,實(shí)驗(yàn)中各參數(shù)變化情況如圖8所示。由圖8可知,結(jié)合酶的最適溫度在35 ℃左右,當(dāng)溫度在35 ℃左右時γ-GCS酶的酶活達(dá)到最高,GSH合成第一步反應(yīng)中獲得γ-谷氨酰半胱氨酸量更多,經(jīng)二步反應(yīng)后最終合成的GSH也更多。

    圖9 溫度調(diào)節(jié)下菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變化曲線Fig.9 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under temperature control

    圖9為發(fā)酵48 h后菌體生物量、胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量的變情況。由圖9可知,菌體生物量(干質(zhì)量)在34 h達(dá)到最大,34~48 h內(nèi)變化很小。而胞內(nèi)GSH含量在42 h后才達(dá)最大值,同時GSH產(chǎn)量也在此時達(dá)到最高。發(fā)酵結(jié)束時,菌體生物量達(dá)到(46.30±1.55)g/L,胞內(nèi)GSH含量為(19.84±0.44)mg/g,GSH產(chǎn)量為(918.59±29.22)mg/L。與初始條件相比較,胞內(nèi)GSH含量提高了3.87%,GSH生物量及胞內(nèi)GSH含量到達(dá)最大值的時間也和初始條件一致,但生物量增高了13.70%,最終GSH產(chǎn)量增高了18.17%。

    3 結(jié)論

    本研究開始以工程菌表達(dá)的釀酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶為對象,對其酶活特性進(jìn)行分析,得出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在體外最適的pH值及溫度。接著以γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶學(xué)特性為基礎(chǔ),在釀酒酵母補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)GSH的過程中進(jìn)行pH值控制及溫度優(yōu)化,補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中采用了同時控制碳源(葡萄糖、糖蜜)和氮源補(bǔ)加速度的流加方式,并在發(fā)酵過程嚴(yán)格監(jiān)控發(fā)酵液中乙醇含量和溶氧。在初始條件的基礎(chǔ)上經(jīng)pH值優(yōu)化后,GSH產(chǎn)量達(dá)到最大的周期明顯縮短,胞內(nèi)GSH的含量有一定提高,菌體生物量(干質(zhì)量)和GSH產(chǎn)量有所提高。在溫度后優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)在溫度對菌體生物量的影響明顯,溫度從30~35 ℃后,菌體生物量(干質(zhì)量)明顯提高,胞內(nèi)GSH的含量也有一定提高,最終GSH產(chǎn)量有明顯提高。綜合pH值和溫度控制優(yōu)化的結(jié)果來看,pH值和溫度不僅可以影響菌體的生物量,同樣對胞內(nèi)GSH含量有一定的提高,這與胞內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特性有一致性。

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