4,4’-二異硫氰基茋-2,2’-二磺酸對高糖誘導心肌細胞損傷的保護作用

郭筱王，王 琳，沈明志，程 珂，楊 磊，何曉樂，王曉明

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4,4’-二異硫氰基茋-2,2’-二磺酸對高糖誘導心肌細胞損傷的保護作用

郭筱王，王 琳，沈明志，程 珂，楊 磊，何曉樂，王曉明*

（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院老年病科，西安 710032）

探討高糖誘導心肌細胞損傷過程中氯離子濃度的變化以及氯離子通道阻斷劑4,4’-二異硫氰基茋-2,2’-二磺酸（DIDS）對受損心肌細胞的作用。原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，應用葡萄糖濃度為33mmol/L DMEM培養(yǎng)基，作用72h，構(gòu)建心肌細胞損傷模型。實驗分為對照組、高糖組、高糖+DIDS組和DIDS組。用MTT法檢測細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，氯離子熒光探針（MQAE）檢測細胞內(nèi)氯離子濃度。高糖作用下的心肌細胞存活率呈濃度及時間依賴性降低（＜0.05），流式細胞儀檢測顯示受損心肌細胞以凋亡性損傷為主。MQAE檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組細胞內(nèi)氯離子濃度顯著下降（＜0.05）。心肌細胞存活率及細胞內(nèi)氯離子濃度，DIDS組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。與高糖組比較，高糖+DIDS組心肌細胞存活率顯著升高，細胞內(nèi)氯離子濃度下降明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。氯離子通道參與了高糖誘導的心肌細胞損傷過程，DIDS可在一定程度上減輕以凋亡為主的心肌細胞損傷。

高糖；肌細胞，心臟；細胞凋亡；氯離子

糖尿病的心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因[1]。目前研究認為其主要致病機制是高糖激活了以活性氧（reactive oxygen species，ROS）為核心的線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑等介導的心肌及血管內(nèi)皮細胞損傷[2]。高糖在糖尿病心血管損傷中起到了重要作用[3]。氯離子是機體內(nèi)最豐富的陰離子。心肌細胞膜和細胞器的氯離子通道在調(diào)節(jié)pH、細胞容積及滲透壓等方面發(fā)揮重要作用，并與細胞遷移、增殖、分化及凋亡等密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，氯離子通道阻斷劑4，4’-二異硫氰基茋-2，2’-二磺酸（4，4’-diisothiocyanostilbene-2，2’disulfonic acid，DIDS）能有效抑制死亡受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑誘導的細胞凋亡，挽救受損細胞[5?7]。然而，氯離子通道是否也參與了高糖誘導的心肌細胞損傷，阻斷該通道對高糖誘導的心肌損傷有何影響，目前尚不清楚。本實驗擬在高糖誘導的心肌細胞損傷模型基礎上，通過觀察細胞內(nèi)氯離子濃度及細胞存活率，探討DIDS在高糖誘導心肌細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

0～3d新生SD仔大鼠，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清由美國Hyclone公司提供；D-葡萄糖由VETEC公司提供，D-甘露醇由Solarbio公司提供；DIDS、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、5-溴-2-脫氧核苷尿嘧啶（BrdU）、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒由美國Sigma公司提供；氯離子熒光探針[N-（ethoxycarbonylmethyl）-6-methoxyquinolinium bromide，MQAE]由美國Invitrogen公司提供。

1.2 原代乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

70%乙醇消毒乳鼠，于劍突下剪開胸腔，取出心臟，冰PBS清洗3遍，去除大血管和血污。將心臟置于小燒杯中，剪碎組織。用Ⅰ型膠原酶分6～8次將組織消化完全。收集上清液，加入等體積含血清的DMEM培養(yǎng)基以終止消化，1 000r/min離心5min，棄上清。重懸細胞，200目細胞篩過濾細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，差速貼壁1h。加入終濃度為100μmol/L的BrdU以抑制成纖維細胞生長。5% CO2細胞培養(yǎng)箱37℃孵育24h后，更換含BrdU的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48h，備用。

1.3 實驗分組與藥物處理

原代培養(yǎng)的心肌細胞隨機分為對照組、高糖組、高糖＋DIDS組及DIDS組。各組處理：對照組采用含血清DMEM培養(yǎng)基（5.5mmol/L葡萄糖＋27.5mmol/L甘露醇）；高糖組采用含血清DMEM培養(yǎng)基（33mmol/L葡萄糖）；高糖＋DIDS組采用含血清DMEM培養(yǎng)基（33mmol/L葡萄糖）＋DIDS（100μmol/L）；DIDS組采用含血清DMEM培養(yǎng)基（5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇）＋DIDS（100μmol/L）分別培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測心肌細胞存活率

將心肌細胞以5×105/ml的濃度接種于96孔板中，每孔100μl。按所需實驗條件處理后，吸棄培養(yǎng)基，加100μl無血清培養(yǎng)基及10μl濃度為5g/L的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后取出，每孔加150μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收度（）值（值與活細胞數(shù)呈正比），以無細胞只加DMSO的調(diào)零孔測得的值為本底值，計算細胞存活率。細胞存活率＝（實驗組值－本底值）/（對照組值－本底值）×100%。實驗至少重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡

參照AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明進行試驗。各組心肌細胞按實驗條件處理后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，每組約收集1×106個細胞，將消化的細胞用PBS，1000r/min離心洗滌5min，洗滌離心后，棄掉PBS，用2.5ml帶血清培養(yǎng)基重懸細胞，AnnexinⅤ-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡情況。結(jié)果判定：左下象限為正常細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，左上象限為死細胞。

1.6 MQAE檢測細胞內(nèi)氯離子濃度

將心肌細胞接種于48孔板中，并按所需實驗條件處理細胞。用Krebs-HEPES緩沖液將MQAE配制成濃度為10mmol/L的工作液，每孔加入100μl MQAE工作液，5%CO2細胞培養(yǎng)箱37℃孵育1h，隨后用Krebs-HEPES緩沖液洗滌5次，每次5min。倒置熒光顯微鏡進行熒光檢測，并拍攝熒光照片。每組隨機選取5個細胞，用Image J軟件分析每個細胞的熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 高糖對心肌細胞存活率的影響

正常葡萄糖濃度（5.5mmol/L）心肌細胞存活率定義為100%。MTT結(jié)果顯示，經(jīng)葡萄糖濃度分別為5.5，11，22，33，44mmol/L的DMEM培養(yǎng)基分別處理0，24，48，72，96h后，高糖作用下的心肌細胞存活率呈濃度及時間依賴性降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05；圖1）。33mmol/L葡萄糖作用72h，心肌細胞存活率為（73.2%±4.1%），以此濃度和時間作為高糖誘導細胞損傷的實驗條件。

圖1 高糖對心肌細胞存活率的影響

Figure 1 Effect of high glucose on cardiomyocyte viability

2.2 高糖對心肌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組細胞狀態(tài)良好，凋亡率為（6.6%±1.2%）。與對照組比較，高糖組細胞凋亡率為（26.8%±3.1%），凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05；圖2）。

2.3 高糖對心肌細胞氯離子濃度的影響

細胞內(nèi)氯離子使MQAE熒光探針發(fā)生淬滅，MQAE熒光強度與細胞內(nèi)氯離子濃度呈負相關(guān)。DIDS組與對照組的細胞內(nèi)氯離子濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與對照組比較，高糖組細胞內(nèi)氯離子濃度顯著下降（＜0.05）；與高糖組比較，DIDS＋高糖組細胞內(nèi)氯離子濃度下降明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05；圖3）。高糖組細胞內(nèi)氯離子濃度較對照組明顯減少，提示高糖誘導了心肌細胞內(nèi)氯離子外流。

2.4 DIDS對高糖誘導心肌細胞損傷的影響

對照組心肌細胞存活率定義為100%。DIDS組與對照組心肌細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；高糖組心肌細胞存活率為（72.2%±2.85%），與對照組比較，細胞存活率顯著下降（＜0.05）；高糖＋DIDS組心肌細胞存活率為（83.3%±3.69%），與高糖組比較，細胞存活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05；圖4）。

3 討 論

最新研究顯示，2010年中國糖尿病患者已達9240萬，而糖尿病前期的患者更是高達1.48億，防控形勢十分嚴峻[8]。高血糖是糖尿病性心肌損傷的獨立危險因素，糖尿病性心肌病及心衰的發(fā)生發(fā)展與高血糖的持續(xù)時間、嚴重程度密切相關(guān)[9]。在積極控制血糖的同時，尋找預防和減輕心肌及血管損傷的藥物對降低心血管疾病事件顯得尤為重要。然而目前，高糖誘導心肌損傷的機制還不十分清楚。

細胞凋亡過程中伴隨著細胞皺縮，也稱為凋亡性容積減小（apoptotic volume decrease，AVD），氯離子的外流在其中扮演了重要角色[10]。研究表明，AVD是細胞凋亡過程中的早期事件，而阻斷氯離子通道，不僅減輕了AVD，也抑制了隨后的凋亡事件[11,12]。經(jīng)典的細胞凋亡途徑主要有死亡受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑[13]。我們前期在十字孢堿、缺血/再灌注損傷及衣霉素誘導的心肌細胞凋亡模型上，已經(jīng)證實了DIDS可以通過抑制細胞凋亡，從而達到保護受損心肌細胞的目的[5?7,12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖對心肌細胞的損傷呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性，并且這種損傷以凋亡的形式為主。同時證實，在高糖作用下細胞內(nèi)的氯離子濃度明顯降低，說明高糖激活了氯離子通道，導致了氯離子外流。而在高糖作用過程中加用氯離子通道阻斷劑DIDS后，氯離子濃度下降程度明顯減輕，抑制了受損心肌細胞內(nèi)氯離子的外流，并維持了細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而增加了心肌細胞的存活率，達到防護和阻止高糖誘導的心肌細胞損傷的目的，保護了心肌細胞。然而，高糖究竟是通過何種機制使氯離子通道開放以及如何進行調(diào)控？目前尚不清楚。研究顯示，高糖所導致的糖毒性通過直接或間接的方式作用于心肌細胞致其損傷。高糖通過線粒體呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)生了過量的ROS，其不但可以直接導致細胞凋亡，而且同時激活了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。這種酶可以通過抑制甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性使葡萄糖的代謝方式發(fā)生改變，由糖酵解途徑改變?yōu)槎喾N可能引起細胞損傷的生物級聯(lián)反應。主要包括糖基化終末生物的增多和己糖胺途徑，多元醇途徑及蛋白激酶C的激活。除此以外，高糖損傷還可能與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等密切相關(guān)[14]。綜上所述，氯離子通道參與了高糖誘導的心肌細胞損傷過程，阻斷氯離子通道可在一定程度上減輕心肌細胞損傷，有效挽救瀕死心肌細胞。通過對氯離子通道的干預，能夠有效阻止高糖誘導心肌細胞損傷，保護心肌細胞，為糖尿病性心肌病的預防與治療提供新的治療策略和新靶點。

圖2 高糖對心肌細胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of high glucose on cardiomyocyte apoptosis rate

Compared with control group,*＜0.05

圖3 高糖對心肌細胞氯離子濃度的影響

Figure 3 Effect of high glucose on intracellular Cl-in cardiomyocytes

A: control group; B: high glucose group; C: high glucose+DIDS group; D: DIDS group. Compared with control group,*＜0.05; compared with high glucose group,#＜0.05

圖4 DIDS對高糖誘導心肌細胞損傷的影響

Figure 4 Effect of DIDS on high glucose-induced cardiomyocyte injury

A: control group; B: high glucose group; C: high glucose+DIDS group; D: DIDS group. Compared with control group,*＜0.05; compared with high glucose group,#＜0.05

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（編輯: 張青山）

Protective effect of 4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2’-disulfonic acid on high glucose-induced cardiomyocyte injury

GUO Xiao-Wang, WANG Lin, SHEN Ming-Zhi, CHENG Ke, YANG Lei, HE Xiao-Le, WANG Xiao-Ming*

(Department of Geriatrics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

To investigate the change in chloride ion (Cl-) concentration in high glucose-induced cardiomyocyte injury and the role of 4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2’-disulfonic acid (DIDS), a chloride channel blocker, in the injury.Primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes were exposed to glucose (33mmol/L) for 72h to establish the cell model of high glucose-induced injury. The cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups: control group, high glucose group, high glucose+DIDS group and DIDS group. MTT assay was applied to detect cell viability, and flow cytometry was used to measure cell viability and apoptosis. N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide (MQAE) was used to examine the intracellular chloride concentration.High glucose decreased the cardiomyocyte viability in a dose- and time-dependent manner (＜0.05). Cardiomyocyte injury was mainly in the form of apoptosis. Compared to control group, high glucose resulted in a significant decrease in intracellular Cl-in the cardiomyocytes (＜0.05). There was no significant difference in cardiomyocyte viability and intracellular Cl-between the DIDS treated cells and control cells (＞0.05). While, DIDS treatment improved the cardiomyocyte viability and attenuated the decrease in intracellular Cl-in cardiomyocytes after high glucose induction (＜0.05).Cl-is involved in the high glucose-induced cardiomyocyte injury. DIDS attenuates the injury which mainly presents as apoptosis.

high glucose; cardiomyocytes; apoptosis; chloride ion

(81270169).

R541；R587.1

A

10.3724/SP.J.1264.2014.00014

2013?11?13;

2013?12?27

國家自然科學基金(81270169)

王曉明, E-mail: xmwang@fmmu.edu.cn