c-fos、TRPV1導(dǎo)致慢性前列腺炎大鼠神經(jīng)痛的實驗研究*

劉迎嘉張 晨宋國宏

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院病理科（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院中醫(yī)科

c-fos、TRPV1導(dǎo)致慢性前列腺炎大鼠神經(jīng)痛的實驗研究*

劉迎嘉1張 晨1宋國宏2**

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院病理科（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院中醫(yī)科

目的探討慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）疼痛的可能機制。方法自身免疫法建立CNP大鼠模型；Von Frey絲檢測機械刺激縮足閾（paw withdrawal threshold，PWT）；進(jìn)行前列腺病理學(xué)檢查和免疫組化檢測前列腺與脊髓L5-S2節(jié)段c-fos、TRPV1的表達(dá)變化和相關(guān)性。結(jié)果造模后大鼠PWT下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。前列腺呈現(xiàn)炎癥反應(yīng)，在病變范圍、淋巴細(xì)胞浸潤方面都較對照組顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，模型組前列腺與脊髓背角L5-S2 中c-fos、TRPV1陽性表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。前列腺中與脊髓中的c-fos表達(dá)無相關(guān)關(guān)系（r=0.027，P=0.454）；并且兩者的TRPV1表達(dá)也無相關(guān)關(guān)系（r=0.000，P=0.5）。結(jié)論 c-fos、TRPV1可能通過脊髓L5-S2節(jié)段的表達(dá)上調(diào)參與了CNP大鼠疼痛的形成和維持。

TRPV1; c-fos; 神經(jīng)痛; 前列腺炎

慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）主要表現(xiàn)為長期反復(fù)的骨盆區(qū)疼痛或不適，癥狀遷延難愈，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響著患者的生活和精神心理狀態(tài)，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。所以進(jìn)一步了解其發(fā)病機制對臨床診治尤為重要。研究顯示CNP疼痛很可能與支配前列腺的神經(jīng)傳導(dǎo)通路和調(diào)控機制的異常有關(guān)，并且這種異常與L5-S2脊髓節(jié)段的繼發(fā)性病變有關(guān)[1]。

本實驗通過復(fù)制CNP大鼠模型，S-P免疫組化法觀察比較前列腺及脊髓L 5-S 2背角中c-fos、TRPV1的表達(dá)變化和相關(guān)性，以期探討CNP疼痛發(fā)生的可能機制，為臨床診治提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料和動物

清潔級雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量160～180g，（新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心）；TRPV1山羊抗鼠單克隆濃縮型抗體，（ABCAM，UK）；c-fos山羊抗鼠單克隆濃縮型抗體，（ABCAM，UK）；S-P試劑盒，（武漢博士徳生物工程有限公司）。蛋白定量測試盒（雙縮脲法），（南京建成生物工程研究所）；TritonX-100，（北京 Solarbio 科技有限公司）；弗氏完全佐劑（FCA），（Sigma，USA）；百白破疫苗，（成都生物制品研究所）。

二、 造模與分組

參照前期實驗[2]利用免疫法建立CNP模型。

取10只雄性Wistar大鼠，取出前列腺組織，加含0.5% TritonX-100等量的生理鹽水制成勻漿離心取上清液。加生理鹽水至濃度為60 mg/mL，以弗氏完全佐劑等比混勻。 Wistar大鼠20只隨機分為模型組和對照組，每組10只。于腹股溝、頸背部、雙后足4點皮內(nèi)注射前列腺蛋白抗原液共1.0 mL，同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL。對照組在相同的時間和部位注射相同體積的生理鹽水。

三、PWT檢測

參照Chaplan等[3]的方法測定機械痛閾。將大鼠置于半透明有機玻璃籠中，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)纖維（Von Frey纖維）刺激后肢足底中部，以纖毛稍彎曲作為完全受力的標(biāo)準(zhǔn)，使纖維彎成S形（代表機械刺激1～50g），持續(xù)6～8s，觀察縮足反應(yīng)。按照克數(shù)順序（2、4、6、8、10、15、26g）依次使用Von Frey絲，每次刺激持續(xù)2s，間隔15 s，連續(xù)5次。能夠引起3/5次抬腿的最低Von Frey絲克數(shù)被定義為PWT。模型組與對照組大鼠于造模后6周進(jìn)行PWT測量，各組在同一時間分別進(jìn)行檢測。

四、前列腺組織病理變化

組織脫水石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察前列腺炎癥反應(yīng)。判定標(biāo)準(zhǔn)[4]如下：

1. 病變范圍為5級：0級基本正常；1級小部分病變；2級部分病變；3級大部分病變；4級全部病變。

2. 淋巴細(xì)胞浸潤程度為3級：0級偶見或未見淋巴細(xì)胞浸潤；1級偶見灶狀分布的淋巴細(xì)胞或散在淋巴細(xì)胞浸潤；2級灶狀淋巴細(xì)胞浸潤或淋巴細(xì)胞浸潤呈片狀分布。

3. 間質(zhì)增生程度為4級：0級間質(zhì)未見纖維增生；1級散在的纖維母細(xì)胞；2級纖維母細(xì)胞呈束狀分布；3級纖維組織膠原變性或玻璃樣變性。

五、前列腺及脊髓免疫組化檢查

按S-P 試劑盒操作進(jìn)行免疫組化染色。綜合染色強度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量積分法判斷結(jié)果。陽性細(xì)胞率積分：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～30%為1分，31%～60%為2分，61%～90%為3分，＞90%為4分。染色強度積分：無特異性染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項積分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況觀察

造模6周后模型組大鼠體質(zhì)量輕微減輕，活動減少，有弓背現(xiàn)象，被毛豎起。輕觸大鼠皮毛或輕輕扣擊其雙下肢時發(fā)生嘶叫并有逃避行為，對抓捕反應(yīng)敏感。對照組大鼠一般情況良好。

二、PWT變化

造模后大鼠PWT下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 造模后大鼠PWT變化

三、 前列腺組織病理學(xué)檢測

模型組大鼠前列腺腺體形態(tài)不規(guī)則，部分腺上皮脫落，基底膜消失，間質(zhì)可見較多淋巴細(xì)胞浸潤，局部區(qū)域可見纖維組織增生，血管擴張充血（見圖1）。對照組前列腺腺體形態(tài)規(guī)則，上皮結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)較多粉染蛋白沉積物，間質(zhì)無淋巴細(xì)胞浸潤，見圖1，圖2。

圖1 模型組炎癥顯著 (HE×100)

造模后前列腺呈現(xiàn)顯著炎癥反應(yīng)，病變范圍、間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤都較對照組反應(yīng)程度有所加重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）, 見表2。

圖2 對照組無炎癥表現(xiàn) (HE×100)

表2 造模后大鼠前列腺炎癥變化

四、c-fos、TRPV1在前列腺與脊髓中的蛋白表達(dá)

c-fos陽性定位在前列腺上皮胞核內(nèi)著棕黃色顆粒，間質(zhì)不著色。模型組前列腺上皮大多數(shù)顯c-fos陽性，沿腺上皮連續(xù)分布（見圖3A）。對照組少許c-fos陽性，呈斷續(xù)分布（見圖3B）。

模型組脊髓c-fos 陽性細(xì)胞主要集中在脊髓淺層，Ⅰ層和Ⅱ?qū)印ｊ栃陨窠?jīng)元呈多形性，圓形或卵圓形周圍有突起（見圖3C）。對照組脊髓背角無c-fos表達(dá)（見圖3D）。

TRPV1陽性定位于前列腺上皮胞漿或胞膜，著棕黃色顆粒，間質(zhì)不著色。模型組大多數(shù)顯示TRPV1陽性表達(dá)，腺上皮呈廣泛連續(xù)陽性顯色（見圖3E）。對照組前列腺少有陽性表達(dá)（見圖3F）。兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

模型組TRPV1在脊髓背角淺層神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，呈三角形、圓形、橢圓形，間質(zhì)不表達(dá)（見圖3G）。對照組脊髓背角TRPV1少有表達(dá)（見圖3H）。

五、前列腺與脊髓中c-fos、TRPV1表達(dá)變化與相關(guān)性

與對照組相比，模型組前列腺與脊髓背角L5-S2中c-fos、TRPV1陽性表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、表4。

前列腺中與脊髓中的c-fos蛋白表達(dá)無相關(guān)關(guān)系（r=0.027，P=0.454）；與此同時，兩者的TRPV1蛋白表達(dá)也無相關(guān)關(guān)系（r=0.000，P=0.5）。

討 論

CNP疼痛一直以來都是男科與泌尿科急待解決的問題。Tripp等[5]認(rèn)為CNP患者的健康相關(guān)生命質(zhì)量評分，比糖尿病和充血性心力衰竭患者的還要低。有研究顯示CNP疼痛部位與前列腺所在部位存在明顯差距，為典型內(nèi)臟痛；疼痛并不一定與組織損害和范圍成比例，而且在感染控制的情況下疼痛仍可存在[6]，說明CNP疼痛的產(chǎn)生不一定是由前列腺本身病變引起，很可能與支配前列腺的神經(jīng)傳導(dǎo)通路和調(diào)控機制的異常有關(guān)，而這種異常與L5-S2脊髓節(jié)段的繼發(fā)性病變有關(guān)[1]。

圖3c-fos、TRPV1在各組大鼠前列腺及脊髓中的表達(dá)

表3 前列腺c-fos、TRPV1蛋白表達(dá)

表4 脊髓c-fos、TRPV1免疫組化表達(dá)

c-fos基因是一種細(xì)胞原癌基因，屬于轉(zhuǎn)錄因子的早期即刻基因家族一員。研究發(fā)現(xiàn)缺氧、光、機械、疼痛等多種刺激因子可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達(dá)上調(diào)[7]。1987年Hunt等[8]率先證實，傷害性刺激可誘導(dǎo)大鼠脊髓背角產(chǎn)生大量fos蛋白。目前將c-fos作為一種細(xì)胞激活的標(biāo)志和細(xì)胞活動定位的標(biāo)記[9]。

本實驗造模后前列腺呈現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)，檢測大鼠PWT值降低，說明自身免疫法建立CNP模型成功。c-fos在模型組前列腺中表達(dá)上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示c-fos在CNP大鼠炎癥的形成中起了一定的作用。本實驗觀察到模型組脊髓背角神經(jīng)元c-fos陽性表達(dá)上調(diào)，而且主要分布在脊髓背角Ⅰ層和Ⅱ?qū)?，其它層分布較少，提示c-fos陽性神經(jīng)元的分布與傳遞外周傷害性信息的初級傳入纖維和終末的終止部位相一致，這些二級神經(jīng)元參與了疼痛信息的傳導(dǎo)和調(diào)控。前列腺與脊髓背角c-fos表達(dá)均上調(diào)，但無相關(guān)關(guān)系，提示雖然炎癥作為致痛因素參與了CNP疼痛的形成，但可能脊髓背角L5-S2節(jié)段的神經(jīng)病理變化在疼痛過程中起著更重要作用。

Grey等[10]發(fā)現(xiàn)TRPV1基因缺失小鼠經(jīng)角叉菜膠、完全弗氏佐劑、芥末油等致炎后對熱刺激敏感增高不明顯，但對機械刺激產(chǎn)生高敏感性；野生型小鼠致炎后，表現(xiàn)為對熱和機械產(chǎn)生痛敏反應(yīng)的潛伏期縮短，激活閾值降低，提示TRPV1參與了炎癥誘導(dǎo)的熱、機械刺激痛，但機械刺激痛還可能有其他傳導(dǎo)通路。Bolcskei等[11]在糖尿病神經(jīng)痛小鼠腳掌內(nèi)注入PKC（蛋白激酶C）激活劑，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生明顯痛覺防御行為，敲除TRPV1基因后，痛覺防御行為消失。

本實驗?zāi)Ｐ徒M前列腺TRPV1表達(dá)上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示TRPV1參與了CNP炎癥的形成。造模后大鼠PWT降低，脊髓背角TRPV1表達(dá)上調(diào)，提示TRPV1可能通過脊髓神經(jīng)元的顯著上調(diào)，使脊髓神經(jīng)元致敏，導(dǎo)致痛閾下降出現(xiàn)中樞敏化。前列腺與脊髓TRPV1表達(dá)均上調(diào)，但二者無相關(guān)關(guān)系，說明TRPV1在脊髓水平L5-S2節(jié)段通過合成增加進(jìn)行中樞調(diào)控可能是CNP疼痛的重要因素之一。

綜上所述，CNP疼痛可能分別通過c-fos、TRPV1脊髓水平的表達(dá)上調(diào)，參與背角L5-S2節(jié)段神經(jīng)元病理性激活，降低痛閾，引起脊髓中樞痛覺敏化疼痛產(chǎn)生。但有關(guān)c-fos 與TRPV1在CNP疼痛神經(jīng)傳導(dǎo)與中樞調(diào)控中的深入關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

1 Ishigooka M, Nakada T, Hashimoto T,et al. Spinal substance P immunoreactivity is enhanced by acute stimulation of the rat prostate.Urology2002; 59(1): 139-144

2 劉迎嘉, 張晨, 宋國宏, 等. COX2在慢性前列腺炎大鼠神經(jīng)痛中變化的實驗研究. 中國男科學(xué)雜志 2012; 26(7): 8-12

3 Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW,et a1. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods1994; 53(1): 55-63

4 徐叔云. 藥理實驗方法學(xué). 第三版. 北京, 人民衛(wèi)生出版社, 2003: 1558

5 Tripp DA, Curtis Nickel J, Landist JR,et al. Predictor of quality of life and pain in chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome:f ndings from the National Institute of Health Chronic Prostatitis Cohort Study.BJU Int2004; 94(9): 1279-1282

6 Herati AS, Moldwin RM. Alternative therapies in the management of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.World J Urol2013; 31(4): 761-766

7 Vanelzakker M, Fevurly RD, Breindel T,et al. Environmental novelty is associated with a selective increased in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex.Learn Mem2008; 15(12): 899-908

8 Hunt SP, Pini A, Evan G. Induction of C-fos-like protein inspinal cord neurons following sensory stimulation.Nature1987; 328(6131): 632-634

9 Day HE, Kryskow EM, Nyhuis TJ,et al.Conditioned fear inhibits c-fos mRNA expression in the central extended amygdale.Brain2008; 1229: 137-146

10 Grey C, Mery A, Puceat M. Fine-tuning in Ca2+homeostasis underlines progression of cardiomyopathy in myocytes derived from genetically modif ed embryonic stem cells.Hum Mol Genet2005; 14(10): 1367-1377

11 Bolcskei K, Helyes Z, Szabo A,et al. Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-def cient mice.Pain2005; 117(3): 368-376

（2014-04-20收稿）

Study on the role of c-fos and TRPV1 in neuralgia of rats with chronic prostatitis*

Liu Yingjia1, Zhang Chen1, Song Guohong2**
1. Department of Pathology, Fifth Aff liated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumuqi 830011, China; 2. Department of Triditonal Chinese Medicine, Fifth Aff liated Hospital, Xinjiang Medical University

Song Guohong, E-mail: songguohong69@sina.com

ObjectiveTo explore the possible mechanisms of chronic nonbacterial prostatitis pain.MethodsThe CNP rat model was established by the immune method. The pain threshold were detected by Von Frey filament. The expressions of c-fos and TRPV1 in the prostate and spinal L5- S2 segmental were detected by immunohistochemistry.ResultsThe PWT of rat model group was signif cantly decreased as compared with that of the control group (P<0.05). There were significant inflammation in prostate tissues of rats. The differences in the scope of lesions and interstitial lymphocytic inf ltrates were statistically signif cant between model group and the control group (P<0.05). The expressions of c-fos and TRPV1 in prostate and spinal cord dorsal horn L5 - S2 in model group were all upregulated remarkably compared with that of the control group (P<0.05). The expression of c-fos and TRPV1 in the prostate had no correlation with that in spinal cord (r=0.027，P=0.454;r= 0.000,P= 0.000).ConclusionFormation of the pain in rats may be associated with upregulation of c-fos and TRPV1 in the spinal L5 - S2 section.

transient receptor potential ion channel protein-1; c-fos; neuralgia; prostatitis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.003

R 697.33

資助: 國家自然科學(xué)基金資助項目（No：81060321）
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, E-mail: songguohong69@sina.com