雷竹筍殼多糖超聲輔助酶法提取工藝 及其抗氧化活性

◎ 劉 于，賀 亮，謝 娜，李 琴，王衍彬，程俊文，趙建誠(chéng)，陳永健

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.國(guó)家林業(yè)局竹筍工程技術(shù)研究中心，浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省竹類研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州 313399）

雷竹是禾本科剛竹屬早竹的栽培種。其主要分布于中國(guó)浙江。雷竹的竹筍味道特別鮮美，并且筍期較早，持續(xù)時(shí)間久，因此產(chǎn)量很高,是相當(dāng)好的筍用竹種。然而，雷竹筍作為一個(gè)全綠色純天然的食物，其蛋白質(zhì)和膳食纖維的含量都很高，同時(shí)糖類和脂類含量也非常低，還富含各種身體所需要的氨基酸和微量礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，因此受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。此外，雷竹筍也有著漫長(zhǎng)的食用史，它只是人們餐桌上的一個(gè)家常菜品[1-3]。竹筍殼作為竹筍食用后的剩余物，也多作為動(dòng)物飼料，但大部分已被拋棄，無(wú)法反映其實(shí)用價(jià)值。但科學(xué)研究表明雷竹筍外殼中還存在著一定的生物活性成分，其中還含有黃酮、多糖、黃酮、甾醇和酚類等，通過(guò)開(kāi)發(fā)或再利用雷竹筍殼資源，并提取其中的多糖化合物，不但能夠達(dá)到資源的高度開(kāi)發(fā)利用，同時(shí)在醫(yī)學(xué)研發(fā)等方面也有著巨大的發(fā)展前景。目前，最常見(jiàn)的多糖萃取方式有熱水浸泡提法[4]、酸提法以及堿提法[5]等，其中酸提法以及堿提法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求比較高，并且容易引起多糖結(jié)構(gòu)的改變。超聲輔助法有助于減少提取時(shí)間，并且適應(yīng)性廣泛、運(yùn)行成本低。此外，超聲輔助法提取的藥液中含有的無(wú)效雜質(zhì)比較少，并且提取出的有效成分易于精制。酶解法具有專一性強(qiáng)、高效性的特點(diǎn)，可以催化雷竹筍中纖維素的分解[6]。將超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖，可以使雷竹多糖溶出的效果更佳，并且可提高雷竹多糖獲取率[7]。

到目前為止，還未有將超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖的相關(guān)文獻(xiàn)。本文將采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖的工藝進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，來(lái)確定其最佳的工藝流程，并對(duì)其提取出的雷竹筍殼多糖進(jìn)行體外抗氧化活性的研究，為能夠最大限度地對(duì)雷竹筍殼的再加工和綜合利用提供理論支撐以及技術(shù)支持[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酚類、單糖標(biāo)品、葡萄糖刺激標(biāo)品、95%乙醇和濃硫酸等試劑（分析純），成都科龍化學(xué)品公司；水楊酸、過(guò)氧化氫和硫酸亞鐵，成都審計(jì)意見(jiàn)化學(xué)試劑廠；維生素C、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海阿拉丁生物科技股份有限公司；果膠酶、纖維素酶和蛋白質(zhì)酶，憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海一科儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZLS-3型真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司；CL31R型多功能高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵，鞏義市予劃科技有限公司；FA二千零四型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；LT-DBX60N型精密可程序化電烤箱，立德泰勒科學(xué)儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雷竹筍殼預(yù)處理

用水沖洗雷竹筍殼使其潔凈后，放在55 ℃的烘箱中烘干，干燥之后打粉，過(guò)80目篩，備用[11]。

1.3.2 雷竹筍殼多糖的提取

取一定量的雷竹筍殼粉末，按料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調(diào)pH至4.5，加蛋白質(zhì)酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1，在一定的溫度和超聲頻率中酶解一段時(shí)間，然后將得到的浸提液置于沸水浴中15 min，使酶失活，再將浸提液進(jìn)行抽濾后，將所得濾液混合，在60 ℃下減壓濃縮至1/3體積，加入4倍體積的95%乙醇，然后醇沉24 h，在5 000 r·min-1下離心10 min，收集沉淀，通過(guò)冷凍干燥得到雷竹筍殼的粗多糖。

1.3.3 雷竹筍殼多糖得率的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液選取葡萄糖水溶液，將其在490 nm處用紫外-分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖水溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.383 9x+0.036 7，R2=0.988 1，該標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系。精確稱2.0 g雷竹筍殼粗多糖到100 mL的容量瓶中，然后滴加蒸餾水至刻度線來(lái)定容，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，雷竹筍殼多糖提取率的計(jì)算如下：

式中：c為配制多糖溶液濃度，g·L-1；V為粗多糖溶液體積，L；m0為雷竹筍殼質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在室溫下，探究不同超聲功率、提取時(shí)間、復(fù)合酶添加量、料液比以及酶解溫度對(duì)雷竹筍殼多糖得率的影響。

（1）超聲功率的確定。精確稱取10 g雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在提取時(shí)間105 min，酶添加量2.0%，酶解溫度55 ℃的條件下，分別用100 W、150 W、200 W、250 W和300 W的功率進(jìn)行超聲處理，研究不同超聲功率對(duì)雷竹筍殼多糖提取率的影響。

（2）提取時(shí)間的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在超聲功率為200 W，復(fù)合酶添加量為2.0%，酶解溫度55 ℃的條件下，分別提取45 min、75 min、105 min、135 min和165 min，研究不同提取時(shí)間對(duì)雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

（3）復(fù)合酶添加量的確定。精確稱取10 g的雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在超聲功率200 W，提取時(shí)間105 min，酶解溫度55 ℃的條件下，分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的復(fù)合酶，研究不同復(fù)合酶添加量對(duì)雷竹筍殼多糖提取率的影響。

（4）料液比的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，在提取時(shí)間105 min，超聲功率為200 W，復(fù)合酶添加量為2.0%的條件下，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g∶mL）條件下，研究不同料液比對(duì)雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

（5）酶解溫度的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，在提取時(shí)間105 min，超聲功率為200 W，料液比1∶30，復(fù)合酶添加量為2.0%，酶解溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃的條件下，研究不同酶解溫度對(duì)雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素及水平表

1.4 雷竹筍殼多糖的抗氧化研究

1.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定方法

參考李松昂等[12]的研究，配制出0.1～0.5 mg·mL-1不同濃度的雷竹筍殼多糖溶液，待測(cè)，各取1.0 mL雷竹筍殼多糖待測(cè)溶液置于試管當(dāng)中，然后添加3.0 mL用95%乙醇溶解的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0為空白樣品溶液的吸光度值；A1為樣品溶液的吸光度值；A2為以蒸餾水代替DPPH的樣品溶液的吸光度值。

1.4.2 羥自由基清除率的測(cè)定方法

參考葉兆偉等[13]的方法稍作修改后來(lái)測(cè)定羥自由基清除率。配制0.1～0.5 mg·mL-1不同濃度的雷竹筍殼多糖待測(cè)溶液，將2.0 mL濃度為9.0 mmol·L-1的FeSO4溶液、2.0 mL 濃度為 8.8 mmol·L-1的 H2O2溶液以及2.0 mL濃度為9.0 mmol·L-1的水楊酸乙醇液相繼加入到待測(cè)溶液中，搖勻，在室溫下放置30 min，待其穩(wěn)定，通過(guò)紫外-分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定不同濃度的雷竹筍殼多糖樣品液的吸光度，采用維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照液。羥自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0為空白樣品在510 nm處的吸光度值；Am為樣品溶液在510 nm處的吸光度值；Aj為不加顯色劑H2O2的吸光度值。

1.4.3 還原能力的測(cè)定方法

參考李松昂[12]的方法稍加改動(dòng)。分別精密吸取1 mL提前配好的不同質(zhì)量濃度的雷竹筍殼多糖待測(cè)液于5個(gè)試管中，加入2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.01的K3[Fe(CN)6]水溶液，拌勻，放置在50 ℃的恒溫水浴中20 min，然后加2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的TCA，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，加入同體積的蒸餾水，然后再加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化鐵，在常溫下放置10 min，使其充分反應(yīng)，待溶液的顏色從黃色變?yōu)樗{(lán)色后，在710 nm下測(cè)定吸光度，采用維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照液。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲波功率的確定

由圖1可知，當(dāng)超聲功率低于200 W時(shí)，雷竹筍殼多糖提取率隨著超聲波功率的增加而增大；當(dāng)超聲功率達(dá)到200 W后，多糖提取率開(kāi)始下降，這可能是超聲波功率在200 W時(shí)，多糖趨于最大提取率，多糖幾乎全部溶出，繼續(xù)增大超聲波功率，對(duì)多糖提取率沒(méi)有明顯的影響。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選取200 W為適宜的超聲波功率。

2.1.2 提取時(shí)間的確定

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間小于105 min時(shí)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取效率越高；在提取時(shí)間達(dá)到105 min以后，雷竹筍殼多糖的提取效率不僅不會(huì)因?yàn)樘崛r(shí)間的延長(zhǎng)而提高，相反發(fā)生了些許的減少，這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，少部分雷竹筍殼多糖出現(xiàn)了分解現(xiàn)象，使雷竹筍殼多糖提取率不能繼續(xù)增大。因此，雷竹筍殼多糖的最適宜提取時(shí)間為105 min。

2.1.3 復(fù)合酶添加量的確定

由圖3可知，多糖提取率隨著復(fù)合酶添加量的增加而逐漸增加；當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到2.0%后，隨著復(fù)合酶添加量的繼續(xù)增加，雷竹筍殼多糖提取率不再明顯增加，這可能因?yàn)閺?fù)合酶濃度已經(jīng)接近飽和，雷竹筍殼中的多糖幾乎全部溶出，所以多糖提取率不再隨著復(fù)合酶添加量的增加而顯著增加。因此，雷竹筍殼多糖最適宜的復(fù)合酶添加量為2.0%。

2.1.4 料液比的確定

由圖4可知，多糖提取率隨著料液比的增加而逐漸增加；當(dāng)料液比超過(guò)1∶30后，多糖提取率略有增加，但不再明顯增加，這可能因?yàn)殡S著溶液濃差的減少，雷竹筍殼中的多糖較難從細(xì)胞內(nèi)溶出，所以多糖提取率不再顯著增加。因此，考慮后續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)濃縮能耗，雷竹筍殼多糖料液比選擇1∶30。

2.1.5 酶解溫度的確定

由圖5可知，多糖提取率隨著酶解溫度的增加而逐漸增大，當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，酶解溫度取得最大值。這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增大溫度，可以顯著提高纖維素酶和果膠酶等復(fù)合酶水解細(xì)胞壁的效果，有利于內(nèi)容物溶出，從而提高多糖的提取率。但溫度繼續(xù)升高反而降低了酶活力。考慮到高效使用復(fù)合酶，選擇55 ℃為最優(yōu)的復(fù)合酶酶解溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)響應(yīng)面法，考慮單因素對(duì)雷竹筍多糖提取率的顯著影響，篩選超聲功率（A）、提取時(shí)間（B）和復(fù)合酶添加量（C）3個(gè)因素進(jìn)行分析，其試驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖獲得率Y的二次回歸擬合曲線方程為Y=2.33+0.107 5A-0.011 2B+0.033 8C-0.035 0AB-0.020 0AC-0.067 5BC-0.056 3A2-0.078 8B2-0.053 8C2。

表3 各因素回歸方程的方差分析表

由表3可知，該模型概率值P＜0.000 1，說(shuō)明該模型顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.118 3），同時(shí)說(shuō)明其他的外界因素對(duì)于試驗(yàn)基本沒(méi)有干擾；由校正決定系數(shù)R2adj=0.972 2，模型的決定系數(shù)R2=0.987 8，得出該試驗(yàn)的設(shè)計(jì)較為合理，98.78%響應(yīng)值的變化可以通過(guò)建立的模型進(jìn)行解釋，因此雷竹筍殼多糖得率的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值能夠比較好地?cái)M合，且試驗(yàn)誤差較小，可以用此模型對(duì)超聲輔助酶解法提取雷竹筍殼多糖的最佳條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[17]。通過(guò)F值的大小比較可以得出，各因素對(duì)多糖提取效果的影響順序?yàn)槌暪β剩緩?fù)合酶添加量＞提取時(shí)間，并且本次研究所選取的因素范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)雷竹筍殼多糖得率均有明顯的影響。

2.2.2 兩因素交互作用分析

超聲輔助酶解法提取雷竹筍殼多糖試驗(yàn)中超聲功率、復(fù)合酶添加量和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)雷竹筍殼多糖提取率的影響結(jié)果如圖6所示。

通常因子間二者交互效應(yīng)的明顯程度可由響應(yīng)面的曲面形狀的陡緩程度和等高線圖的形狀來(lái)顯示，當(dāng)因子間交互作用明顯時(shí)，曲面較陡且等高線為橢圓形，若曲面圖形中曲面較緩，且等高線趨向于圓形，則說(shuō)明因子間的交互效應(yīng)不明顯[14,16]。由圖6可知，由因子A和B，B和C相互影響的3D曲面圖中的曲面比較陡，且等高線密集成橢圓形，說(shuō)明了超聲波功率A與提取時(shí)間B、提取時(shí)間B與酶添加量C間的交互作用對(duì)雷竹筍殼多糖提取率影響很明顯；因素A和C間交互作用的曲面圖中曲面變化較緩，而等高曲線則趨向于長(zhǎng)圓形，說(shuō)明在超聲波功率A和酶添加量C間的交互影響對(duì)其多糖提取率并不顯著。以上分析出的結(jié)果與方差分析出的結(jié)果基本一致，說(shuō)明響應(yīng)面結(jié)果可靠。

2.3 雷竹筍殼多糖最佳提取工藝的確定

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到雷竹筍殼多糖的最佳提取工藝條件為料液1∶30（g∶mL），超聲波功率210 W，提取時(shí)間112 min，復(fù)合酶添加量2.1%，提取溫度55 ℃。在最優(yōu)條件下雷竹筍殼多糖提取率為2.28%。3次重復(fù)試驗(yàn)后得到的雷竹筍殼多糖的平均提取率為（2.24±1.57）%，達(dá)到了回歸模型預(yù)測(cè)提取得率的98.24%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，響應(yīng)面模型具有一定可行性。

2.4 抗氧化性結(jié)果與分析

2.4.1 DPPH自由基清除率結(jié)果分析

如圖7所示，當(dāng)濃度在0.1～0.5 mg·mL-1，雷竹筍殼多糖對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除功能，其清除功能隨著濃度的提高而逐步加強(qiáng)。當(dāng)雷竹筍殼多糖溶液濃度高于0.2 mg·mL-1時(shí)，雷竹筍殼多糖對(duì)DPPH自由基的清除率不再隨著多糖溶液濃度的增加而增大。維生素C陽(yáng)性對(duì)照溶液中對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于雷竹筍殼多糖。由此可見(jiàn)，雷竹筍殼多糖溶液對(duì)DPPH自由基具有清除能力，表現(xiàn)出較高的抗氧化性。

2.4.2 羥自由基清除率結(jié)果分析

羥自由基（·OH）是一種活性氧，其可以使紅細(xì)胞失活，并且是已知的自由基中毒性最大的一種，及時(shí)消除身體中的羥自由基對(duì)延緩機(jī)體衰老以及維持身體健康均具有良好的效果[15]。由圖8可知，雷竹筍殼精制多糖可以清除羥自由基并且效果良好，在0.1～0.5 mg·mL-1，多糖質(zhì)量濃度越高，清除羥自由基的作用越強(qiáng)。當(dāng)濃度高于0.3 mg·mL-1時(shí)，羥自由基的清除率增加變緩。陽(yáng)性對(duì)照液維生素C對(duì)羥自由基的清除率優(yōu)于雷竹筍殼多糖。

2.4.3 還原能力的測(cè)定方法

由圖9可知，隨著雷竹筍殼多糖溶液的增加，其吸光度值的變化不顯著，說(shuō)明雷竹筍殼多糖還原性不高。在相同質(zhì)量濃度條件下，維生素C的吸光度明顯高于雷竹筍殼多糖。

綜合考慮，雷竹筍殼多糖在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羥自由基清除作用，但總體還原力不強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文選用超聲輔助酶法提取雷竹筍殼多糖，以雷竹筍殼多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定其最佳提取條件為超聲功率210 W，酶解時(shí)間112 min，復(fù)合酶添加量2.1%，提取溫度55 ℃。在最優(yōu)條件下的雷竹筍殼多糖提取率為（2.24+1.57）%，與預(yù)測(cè)值（2.28%）基本上相吻合。雷竹筍殼多糖濃度在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羥自由基清除作用，但其還原能力相對(duì)薄弱且不如維生素C。其消除能力與雷竹筍殼多糖的質(zhì)量濃度有明顯的關(guān)系[17]。本試驗(yàn)的研究成果將對(duì)雷竹筍殼的再加工和綜合利用提出了理論支撐，并具有相應(yīng)的參考價(jià)值。