PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

◎ 周振杰

（甘肅省莊浪縣市場監(jiān)督管理局（甘肅省莊浪縣食品藥品稽查局）,甘肅 莊浪 744699）

在食品微生物檢測工作中采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)時，應(yīng)形成正確的技術(shù)應(yīng)用認知，制定完善的技術(shù)方案，通過有效的措施提高食品微生物檢測工作的效率，發(fā)揮現(xiàn)代化技術(shù)的作用，確保能及時發(fā)現(xiàn)食品微生物問題，并有效解決和應(yīng)對，為保證食品質(zhì)量、維護人們的身體健康和生命安全夯實基礎(chǔ)。

1 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

1.1 大腸桿菌的準(zhǔn)確檢測

傳統(tǒng)的食品微生物檢測技術(shù)能對大腸桿菌進行檢測，但檢測范圍狹窄，而采用PCR技術(shù)能在檢測常規(guī)大腸桿菌的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確檢測出引起人們腸出血的大腸桿菌類別，為食品質(zhì)量和安全管理提供一定的保障。

1.2 沙門氏菌的有效檢測

沙門氏菌具有一定的傳染性，且對人體的危害非常嚴重，甚至有致死性的危害，因此對其進行有效檢測非常重要。而多重類型的PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中，可確保檢測結(jié)果的精確度和精準(zhǔn)性，增強整體檢測工作的有效性和可靠性。

1.3 非致病菌的合理檢測

非致病菌主要涉及乳酸菌，是在自然界廣泛存在且具有一定學(xué)術(shù)研究價值的菌類，與人們的日常生活、生產(chǎn)、食品和醫(yī)療等有密切關(guān)聯(lián)。采用PCR技術(shù)開展乳酸菌的檢測工作，不僅能準(zhǔn)確歸納分析其具體規(guī)律，還能提升整體檢測工作的效率和效果。

此外，在食品檢測過程中采用先進的PCR技術(shù)，還能提升各項檢測工作的便利性、改善目前的工作現(xiàn)狀、增強檢測工作的精確性和科學(xué)性，在滿足衛(wèi)生檢測工作標(biāo)準(zhǔn)的同時，還能促使食品安全管理工作的有效落實和全面開展。

2 PCR技術(shù)分析

2.1 常規(guī)PCR技術(shù)

常規(guī)的PCR技術(shù)在實際應(yīng)用的過程中，主要是設(shè)置DNA模板和引物，制備緩沖液材料和MgCl2溶液，將各類材料有機整合成為反應(yīng)混合物，通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行催化處理，對寡核苷酸引物界定出來的DNA片段進行擴增處理。此類擴增操作是將模板DNA作為基礎(chǔ)部分，進行引物的變性反應(yīng)、退火反應(yīng)和延伸反應(yīng)。在循環(huán)操作的情況下，使目標(biāo)DNA片段出現(xiàn)擴增的現(xiàn)象。通常情況下，各個反應(yīng)周期出現(xiàn)的DNA片段都可作為下個循環(huán)的模板，所以PCR技術(shù)在應(yīng)用期間所產(chǎn)生的產(chǎn)物是以指數(shù)形式增加。例如，在食品微生物檢測過程中使用常規(guī)PCR技術(shù)，可有效檢測沙門氏菌，按照沙門氏菌基因設(shè)置引物，可有效檢測沙門氏菌、多種血清型與菌屬的非沙門氏菌，檢測的準(zhǔn)確性較高。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)在實際應(yīng)用過程中和常規(guī)技術(shù)的應(yīng)用原理相同，不同之處是在相同反應(yīng)體系內(nèi)設(shè)置一對或以上的特異類型引物，構(gòu)建和各個引物特異性進行互補的模板，即可在相同反應(yīng)管內(nèi)擴增多條目標(biāo)DNA片段。此技術(shù)不僅能保留常規(guī)技術(shù)的特異性和敏感性優(yōu)勢，還能簡化檢測工作的步驟、減少試劑的使用劑量、一次性同時擴增多種需要檢測的微生物，因此在食品微生物檢測期間采用多重PCR技術(shù)，能同時檢測多種微生物基因，減少工作人員的工作量。但是，多重PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中存在不足之處，如擴增處理的效率較低、缺乏一定的敏感性。在擴增過程中需要摸索反應(yīng)條件，可能會發(fā)生不同引物之間相互干擾的問題，因此需要結(jié)合具體情況探索多重PCR技術(shù)的應(yīng)用措施和方法。例如，在食品中大腸菌群的檢測過程中采用多重PCR技術(shù)，可利用點對點的方式設(shè)置固定性多聚dT尾捕捉探針，配合使用生物素進行擴增DNA標(biāo)記處理，達到準(zhǔn)確檢測食品微生物的目的。

2.3 RT-PCR技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術(shù)的原理是提取食品組織，或提取食品細胞內(nèi)的總RNA，將其中所存在的mRNA作為模板，利用dT或隨機引物，借助逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的物質(zhì)轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再將其作為模板實現(xiàn)PCR擴增的目的，明確目標(biāo)檢測基因的情況。在食品微生物檢測過程中采用此技術(shù)能提升RNA檢測的靈敏度，甚至能提升多個數(shù)量級，準(zhǔn)確分析微量RNA樣本。例如，在食品微生物檢測的過程中可通過RTPCR技術(shù)進行大腸桿菌噬菌體的檢測分析，將F-RNA平板作為陽性結(jié)果數(shù)據(jù)值的依據(jù)，在SC（Somatic Coliphage）噬菌體和F-RNA（F-specific RNA）噬菌體混合液內(nèi)，可準(zhǔn)確、有效檢測F-RNA噬菌體[1]。

2.4 免疫PCR技術(shù)

免疫PCR技術(shù)是將DNA分子作為主要標(biāo)記物，在進行一般免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，還可有效完成PCR擴增操作、電泳分析操作，整體的免疫試驗效果較高。在食品微生物檢測過程中采用免疫PCR技術(shù)，可提升系統(tǒng)的擴增性能，改善抗原抗體反應(yīng)的特異性，最大程度地增強檢測抗原應(yīng)用的靈敏度，且由于所有DNA分子都屬于可選擇性的固定分子，合成一對引物即可完成操作，可避免在更換檢測對象過程中還需更換引物的問題，簡化了操作流程和操作模式。免疫PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用，通?？蓪⑸锼禺?dāng)作連接分子，而生物素在應(yīng)用過程中具備獨立性的結(jié)合點位，其中一個點位能和DNA分子結(jié)合，另外一個點位能和抗原-抗體復(fù)合物中的親和素之間相互結(jié)合，使DNA分子與抗原-抗體親和素相互整合，最終生成抗原、抗體、親和素、生物素和DNA之間相互融合的復(fù)合物，再進行PCR擴增處理，對DNA進行合理地標(biāo)記即可。

2.5 巢式PCR技術(shù)

巢式PCR技術(shù)需構(gòu)建兩套引物達到PCR擴增處理的目的，通過內(nèi)部和外部兩對引物前后進行靶基因片段的擴增處理，先使用其中一套引物擴增20個左右的循環(huán)，再利用已經(jīng)完成擴增的DNA片段，進入另外一套引物的擴增循環(huán)，循環(huán)20個左右。在此期間第二套引物的設(shè)計片段位置是在第一套引物的擴增片段內(nèi)，因此可將第一套引物稱作外引物，第二套引物稱作內(nèi)引物。此外，巢式PCR技術(shù)的應(yīng)用不僅能提升整體反應(yīng)的特異性，還能獲得非常豐富的特異靶序列，提高整體檢測的敏感度，在食品微生物檢測的過程中，能有效進行基因靶DNA的單拷貝擴增處理，提升整體檢測效率和準(zhǔn)確性[2]。

采用巢式PCR技術(shù)可在首次擴增反應(yīng)完成后開啟反應(yīng)管，去除前一套引物，再設(shè)置另一套引物，整個操作流程較為煩瑣，很容易出現(xiàn)反應(yīng)系統(tǒng)污染的問題，所以目前部分技術(shù)人員在食品微生物檢測過程中對巢式PCR技術(shù)進行了改進，通過引物的改進使外引物退火溫度比內(nèi)引物高，從最開始的反應(yīng)階段就將兩套引物同時設(shè)置在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)，外引物在退火溫度的影響下形成雙溫循環(huán)擴增，而內(nèi)引物不能和模板之間形成較為穩(wěn)定的雙鏈，所以不會起到相應(yīng)的作用。在外引物擴增反應(yīng)完成后，再設(shè)置低火溫的循環(huán)處理，在退火溫度較低的情況下，內(nèi)引物開始發(fā)生反應(yīng)，多次循環(huán)逐漸減小變性溫度，這樣能預(yù)防在整體反應(yīng)過程中PCR最開始的循環(huán)出現(xiàn)原始樣本模板序列產(chǎn)物解鏈的問題，以免內(nèi)引物成為外引物的模板，增強檢測效果的同時彌補了常規(guī)技術(shù)的不足，提升食品微生物檢測工作的質(zhì)量和水平[3]。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中應(yīng)用的基礎(chǔ)保障

3.1 合理選擇儀器設(shè)備

在進行食品微生物檢測前，應(yīng)結(jié)合PCR技術(shù)的應(yīng)用特點和情況，科學(xué)選擇儀器設(shè)備，確保所選用的儀器設(shè)備可進行食品微生物的快速檢測，精確檢驗菌落的總體數(shù)量，精確度控制在合理范圍內(nèi)，重復(fù)性維持在5%以內(nèi)，同時還需結(jié)合食品的特點進行檢測儀器設(shè)備的選擇。例如，牛奶、面包、豆?jié){和果汁等可采用微生物分子檢測儀設(shè)備；食品中的沙門氏菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌等檢測可采用多孔板儀器設(shè)備進行多次試驗分析。同時，在應(yīng)用該技術(shù)過程中還可構(gòu)建多重串聯(lián)類型的實時性熒光定量檢測設(shè)備，如聯(lián)合使用試驗試劑盒、冰箱、滅菌器、梯度儀和核酸電泳儀等，并且在全封閉的環(huán)境下檢測，避免發(fā)生檢測結(jié)果假陽性或假陰性的問題，提升整體檢測分析的精確度[4]。

3.2 合理選擇試驗方法

食品微生物檢測的過程中采用PCR技術(shù)，應(yīng)重點選擇合理的試驗檢測的方法，確保檢測工作的有效開展。例如，采用PCR技術(shù)檢測肉制品中的微生物，可分為以下步驟。①取食品樣本，放入蒸餾水中，加熱攪拌后使樣本溶解，再在高溫、高壓的環(huán)境中進行滅菌。②使用滅菌純水稀釋試驗材料，放置在規(guī)定的溫度環(huán)境中保存，將硼酸等物質(zhì)放置在蒸餾水內(nèi)，調(diào)整pH值，確保pH值在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，然后在高壓滅菌室內(nèi)存儲。③制作瓊脂糖凝膠。稱取數(shù)量符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖，加入反應(yīng)材料，通過微波爐加熱處理，等待所有瓊脂糖溶解后，注入模具內(nèi)進行冷卻。再稱取一定數(shù)量的瓊脂糖，在蒸餾水中溶解，嚴格控制蒸餾水的含量，放置在高溫環(huán)境中進行滅菌處理，滅菌操作時間符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。④構(gòu)建完善的PCR檢測體系，對檢測靶基因擴增處理，將需要檢測的目標(biāo)菌種制作成模板，混合溶液內(nèi)存在的多種菌種，形成多重性的PCR反應(yīng)程序和體系，結(jié)合檢測結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得相應(yīng)的擴增效率指標(biāo)。再按照稀釋倍數(shù)的特點和情況，明確菌落計算數(shù)據(jù)結(jié)果，每隔一段時間完成三重PCR檢測的任務(wù)，如果變異系數(shù)能維持在合理范圍內(nèi)，則證明使用的檢測措施具備較高的重復(fù)性和精確性，能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求[5]。

在牛奶中沙門氏菌含量的測定過程中，采用PCR模板制備技術(shù)開展靈敏度試驗，檢測樣本中沙門氏菌的敏感性情況。①合理選擇樣本，科學(xué)開展純菌培養(yǎng)操作，將牛奶食品樣本放入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)經(jīng)過處理后，存儲在冰箱內(nèi)。②對所有試驗菌株進行接種處理，在液體內(nèi)接種，通過振蕩方式進行液體內(nèi)菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度和振蕩速度控制在規(guī)定范圍內(nèi)。③采用乙醇沉淀技術(shù)進行模板的制備，提取細菌培養(yǎng)液放置在離心機設(shè)備中離心處理，合理控制設(shè)備轉(zhuǎn)速，再使用滅菌蒸餾水進行洗滌，通過懸浮液緩沖，在相應(yīng)的環(huán)境中離心處理，隔水煮沸后加入醋酸鈉物質(zhì)，添加無水乙醇，離心處理后添加緩沖劑進行復(fù)溶，通過乙醇洗滌，放置在冰箱內(nèi)冷卻，完成模板的制作。④將濃度適中的菌液接種在試驗樣本內(nèi)，提取基因組，擴增后繪制擴增數(shù)據(jù)值的表格和圖片，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行樣本中的微生物檢測，明確大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等檢測下限是否符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)要求，如果符合規(guī)定就代表食品中微生物含量合格，如果超出規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)就代表食品中所含微生物超標(biāo)，存在質(zhì)量安全問題。

4 結(jié)語

綜上所述，食品微生物檢測的過程中PCR技術(shù)具有一定應(yīng)用價值和應(yīng)用意義，能提升檢測工作效率。因此在實際檢測工作中需結(jié)合不同類型的PCR技術(shù)特點和情況，有針對性地進行食品微生物的檢測檢驗，提升PCR技術(shù)的應(yīng)用效果，確保能精準(zhǔn)、全面、快速、及時檢測食品內(nèi)的微生物，為有效維護食品質(zhì)量安全提供幫助。