金港欖香烯與欖香烯脂質(zhì)體注射液的指紋圖譜研究*

謝 恬，李鋮璐，徐淑媛，王 宇，楊友劍，趙 宏，劉興元，于麗紅，張滌菲，曾昭武

（1.杭州創(chuàng)新中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究所有限公司，杭州 310053；2.大連華立金港藥業(yè)有限公司，大連 116000；3.杭州師范大學(xué)，杭州 310012）

·中藥研究·

金港欖香烯與欖香烯脂質(zhì)體注射液的指紋圖譜研究*

謝 恬1，2，3，李鋮璐3，徐淑媛1，王 宇2，楊友劍2，趙 宏2，劉興元2，于麗紅2，張滌菲2，曾昭武3

（1.杭州創(chuàng)新中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究所有限公司，杭州 310053；2.大連華立金港藥業(yè)有限公司，大連 116000；3.杭州師范大學(xué)，杭州 310012）

[目的]通過檢測(cè)金港欖香烯與欖香烯脂質(zhì)體注射液的指紋圖譜，考察它們的質(zhì)量穩(wěn)定性。[方法]分別對(duì)10批金港欖香烯與欖香烯脂質(zhì)體注射液，采用氣相色譜法檢測(cè)其指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算相似度。[結(jié)果]采用氣相色譜法檢測(cè)它們的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，發(fā)現(xiàn)欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液都有6個(gè)共有特征峰，各批次欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液的相似度都不低于0.995。[結(jié)論]建立的金港欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液指紋圖譜符合要求，為不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性提供了保證。

欖香烯；脂質(zhì)體；注射液；氣相色譜；指紋圖譜

欖香烯（C15H24）是一類單環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜烯類化合物，是從郁金等傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性成分[1]，其中β-欖香烯是主要活性成分。欖香烯對(duì)多種腫瘤具有確切療效，無明顯毒副作用[2]。金港欖香烯脂質(zhì)體注射液采用循證醫(yī)學(xué)系統(tǒng)評(píng)價(jià)證實(shí)欖香烯脂質(zhì)體注射液安全有效，且可延長(zhǎng)生存期、改善生活質(zhì)量、抗腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[3-7]。為了保證欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液的質(zhì)量并對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量實(shí)施有效的監(jiān)控，對(duì)金港欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液的指紋圖譜進(jìn)行研究，具有非常重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agilent6890N氣相色譜儀，HP-5（30mm×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器（美國Agilent公司），DF－101S集熱式恒溫加熱攪拌器（河南省予華儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 將采自瑞安境內(nèi)不同地域（下林、岱西、八甲、綠嶼、登陽、涂頭、東川、四甲、馬嶼、焦炕村）的溫莪術(shù)藥材提取的莪術(shù)油10批進(jìn)行精餾，獲得原料藥欖香烯10批。將該10批欖香烯小試制備欖香烯脂質(zhì)體注射液。藥材采集地、欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。β-欖香烯對(duì)照品（純度97%）、空白制劑與欖香烯脂質(zhì)體注射液（由大連華立金港藥業(yè)有限公司提供）。甲醇、乙酸乙酯為色譜純，無水硫酸鈉、丙酮等為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜條件根據(jù)指紋圖譜技術(shù)要求，參考文獻(xiàn)[8-17]，研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯、欖香烯注射液的指紋圖譜應(yīng)與溫莪術(shù)、莪術(shù)油指紋圖譜具有相關(guān)性，由于需要比較這幾種物質(zhì)的相關(guān)性，因此4種物質(zhì)的指紋圖譜色譜條件最好盡量一致，經(jīng)反復(fù)的篩選，確定儀器條件如下：HP-5色譜柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm），檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度150℃，載氣為氮?dú)?，氮?dú)饬魉伲?.0 mL/min，氫氣：40 mL/min，空氣：400 mL/min，分流比為20∶1，柱溫采取程序升溫，起始溫度125℃，保持8 min，以5℃/min的速率升溫至90℃，保持14 min，再以10℃/min的速率升溫至115℃，然后以1℃/min的速率升溫至130℃，保持25 min，以2℃/min的速率升溫至140℃，保持30 min，以10℃/min的速率升溫至260℃，進(jìn)樣量1 μL，理論板數(shù)按β-欖香烯峰計(jì)算不得低于10000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 將β-欖香烯對(duì)照品用甲醇溶解，稀釋后進(jìn)樣分析。欖香烯、欖香烯脂質(zhì)體注射液中主要有效成分是β-欖香烯，且是欖香烯、欖香烯脂質(zhì)體注射液共有，積分面積在指紋圖譜中比例較大而穩(wěn)定，因此采用β-欖香烯作為參照物。

2.3供試品溶液制備 1）取10批欖香烯作為供試品，分別取100 μL用乙酸乙酯稀釋至1 mL，即得欖香烯供試品溶液。定量吸取1 μL后進(jìn)樣分析。2）取各批次欖香烯脂質(zhì)體注射液2 ml，置10 ml刻度試管中，加無水硫酸鈉0.8 g，振搖使溶解，置60℃水浴破乳5 min，取出，放冷至室溫，加丙酮至10 mL，強(qiáng)力振搖使完全溶解，靜置，取上清液作為欖香烯脂質(zhì)體注射液供試品溶液。

2.4 空白脂質(zhì)體注射液溶液和空白溶劑實(shí)驗(yàn) 取空白脂質(zhì)體注射液2 mL，同“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣。取空白溶劑丙酮，進(jìn)樣。結(jié)果表明，空白注射液在25～47 min間無色譜峰出現(xiàn)，空白注射液在該色譜條件下對(duì)供試品指紋圖譜無干擾，見圖1。丙酮溶劑在25～47 min間無色譜峰，說明丙酮溶劑在該色譜條件下對(duì)供試品指紋圖譜無干擾，見圖2。

圖1 空白脂質(zhì)體溶液氣相色譜圖譜Fig.1 Gas chromatogram of blank liposome solution

圖2 空白溶劑-丙酮?dú)庀嗌V圖譜Fig.2 Gas chromatogram of acetone as blank solvent

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 1）取欖香烯適量，制備供試品溶液，分別于0、2、3、4、5、11 h重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄各共有特征峰保留時(shí)間和積分峰面積。以β-欖香烯為參照峰（S），換算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.008%，0.006%，0.000%，0.008%，0.007%，0.007%，相對(duì)峰面積的RSD分別為 0.722%，0.878%，0.000%，0.228%，0.427%，0.116%，均小于3%，說明整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，樣品在11 h內(nèi)穩(wěn)定，符合要求。2）取欖香烯脂質(zhì)體注射液供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、9、10、11、12 h進(jìn)樣分析。結(jié)果表明各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.0178%，0.0141%，0.0000%，0.0118%，0.0137%，0.0117%，相對(duì)峰面積的RSD分別為0.6952%，0.3412%，0.0000%，0.1782%，0.6593%，0.3548%，RSD均小于3%，說明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定，符合要求。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取金港欖香烯、欖香烯脂質(zhì)體注射液，制備供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，分析。結(jié)果表明，欖香烯或欖香烯脂質(zhì)體注射液共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，欖香烯相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.003%，0.003%，0.000%，0.003%，0.003%，0.002%，相對(duì)峰面積的RSD分別為0.739%，0.847%，0.000%，0.251%，0.476%，0.116%。欖香烯脂質(zhì)體注射液相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.018%，0.013%，0.000%，0.012%，0.014%，0.013%，相對(duì)峰面積的RSD分別為0.887%，0.344%，0.000%，0.142%，0.886%，0.267%。RSD均小于3%，精密度良好，符合要求。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批金港欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液各5份，制備供試品溶液后檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金港欖香烯和欖香烯脂質(zhì)體注射液中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積基本一致，欖香烯相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.022%，0.019%，0.000%，0.016%，0.022%，0.021%，相對(duì)峰面積的RSD分別為0.840%，0.644%，0.000%，0.221%，0.342%，0.216%；欖香烯脂質(zhì)體注射液相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.046%，0.042%，0.000%，0.039%，0.046%，0.042%，相對(duì)峰面積的RSD分別為0.946%，1.396%，0.000%，1.241%，0.838%，0.788%。RSD均小于3%，重現(xiàn)性良好，符合要求。

2.8 指紋圖譜選擇及特征峰的標(biāo)定 根據(jù)金港欖香烯10批供試品氣相色譜圖，選擇代表樣品（3）作為對(duì)照指紋圖譜。并以10批供試品氣相色譜圖譜所給出的相關(guān)參數(shù)，在該色譜條件下得出所有成分的色譜峰，且在47 min內(nèi)全部出完。比較各批供試品色譜圖發(fā)現(xiàn)6個(gè)色譜峰是各批共有，從而確定它們?yōu)楣灿刑卣鞣濉Ｖ讣y圖譜顯示共有特征峰應(yīng)有6個(gè)。相對(duì)保留時(shí)間（峰序號(hào)）依次為：0.9061（1），0.9851（2），1（S），1.0439（3），1.0623（4），1.0709（5）。相對(duì)峰面積（峰序號(hào)）依次為0.0297±0.0131（1），0.0392± 0.0049（2），1.0000（S），0.1153±0.0214（3），0.0155± 0.0109（4），0.0530±0.0320（5）。詳見圖3。10批供試品，以β-欖香烯峰為參照峰，計(jì)算各指紋峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果表明原料藥中β-欖香烯峰面積占80%以上，而其他幾個(gè)峰均小于10%，因此峰面積比值不作要求，但相對(duì)保留時(shí)間比較固定，其RSD小于3%，符合要求。

圖3 金港欖香烯（3）氣相色譜指紋圖譜Fig.3 Gas chromatographic fingerprint of Kingkong elemene(3)

同上，根據(jù)金港欖香烯脂質(zhì)體注射液10批供試品氣相色譜圖，選擇代表樣品（1）作為對(duì)照指紋圖譜。比較各批供試品的色譜圖發(fā)現(xiàn)6個(gè)色譜峰是各批樣品共有，從而確定它們?yōu)楣灿刑卣鞣?，見圖4。6個(gè)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間（峰序號(hào)）依次為：0.9063（1），0.9853（2），1.0000（S），1.0440（3），1.0625（4），1.0710（5）；相對(duì)峰面積（峰序號(hào)）依次為：0.0300±0.0134（1），0.0395±0.0049（2），1.0000（S），0.1141±0.0208（3），0.0154±0.0108（4），0.0493± 0.0301（5）。結(jié)果表明，注射液主成分中β-欖香烯峰面積占80%以上，而其他幾個(gè)峰均小于10%，因此峰面積比值不作要求，但相對(duì)保留時(shí)間比較固定，其RSD小于3%，符合要求。

圖4 金港欖香烯脂質(zhì)體注射液（1）氣相色譜指紋圖譜Fig.4 Gas chromatographic fingerprint of Kingkong elemene liposomal injection(1)

2.9 指紋圖譜相似度及圖譜 以共有模式為參照，采用中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算，得到各批次金港欖香烯指紋圖譜的相似度和圖譜，見表1、圖5。結(jié)果表明各批次金港欖香烯指紋圖譜的相似度均大于0.997。同上，計(jì)算得到各批次金港欖香烯脂質(zhì)體注射液指紋圖譜相似度和圖譜，見表2、圖6，結(jié)果表明各批次金港欖香烯脂質(zhì)體注射液指紋圖譜的相似度均大于0.997。

3 討論

表1 10批金港欖香烯指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果Tab.1 The results of fingerprint similarity of 10 batches of Kingkong elemene

目前，對(duì)欖香烯脂質(zhì)體注射液中欖香烯的含量測(cè)定主要是氣相色譜法[18-19]。氣相色譜法特別適用于含揮發(fā)性成分藥材和制劑的指紋圖譜研究，具有簡(jiǎn)單易行、可比性強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快、分離度好等優(yōu)點(diǎn)[20]。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，確定了欖香烯脂質(zhì)體注射液、欖香烯的最優(yōu)檢測(cè)條件、分析方法，采用氣相色譜法檢測(cè)，樣品的穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性良好。對(duì)金港欖香烯、欖香烯脂質(zhì)體注射液進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果如圖3、4，發(fā)現(xiàn)金港欖香烯脂質(zhì)體注射液各特征峰均可在原料藥金港欖香烯指紋圖譜中得到追蹤，說明具有相關(guān)性，證明了金港欖香烯脂質(zhì)體注射液藥物的質(zhì)量穩(wěn)定可靠。經(jīng)大連華立金港藥業(yè)有限公司質(zhì)量控制部門跟蹤回顧性試驗(yàn)得欖香烯原料藥、欖香烯脂質(zhì)體注射液相似度均在0.996以上。本研究按照《中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗(yàn)研究操作規(guī)程指南(試行)》的規(guī)定，采用相似度計(jì)算軟件進(jìn)行計(jì)算，得到能全面、準(zhǔn)確地反映欖香烯脂質(zhì)體注射液、原料藥質(zhì)量情況的指紋圖譜，比采用單一成分的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)更全面。對(duì)欖香烯脂質(zhì)體注射液、原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制，建立指紋圖譜保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，為保證不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，為中藥注射制劑規(guī)范化生產(chǎn)、走向國際市場(chǎng)奠定了基礎(chǔ)。

圖6 10批金港欖香烯脂質(zhì)體注射液氣相色譜指紋圖譜Fig.6 The gas chromatographic fingerprints of 10 batches of Kingkong elemene liposomal injection

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Study on fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection

XIE Tian1,2,3,LI Cheng-lu3,XU Shu-yuan1,WANG Yu2,YANG You-jian2,ZHAO Hong2,LIU Xing-yuan2,YU Li-hong2,ZHANG Di-fei2, ZENG Zhao-wu3
（1.Hangzhou Innovation TCM Standardization Research Institute Co.,Ltd.,Hangzhou 310053,China;2.Dalian Holley Kingkong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Dalian 116000,China;3.Hangzhou Normal University,Hangzhou 310012,China）

[Objective]To detect the fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection for observing their quality stability.[Methods]The fingerprints of 10 batches of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection were detected by gas chromatography(GC),and their similarity was calculated by the fingerprint similarity calculation software of traditional Chinese medicine(TCM).[Results]The GC method for detecting their fingerprint was stable and reliable.Six common characteristic peaks were all found in Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection.The fingerprint similarity of these batches of Kingkong Elemene or Elemene liposomal injection was not lower than 0.995.[Conclusion]The resulted fingerprint of Kingkong Elemene and Elemene liposomal injection meet the requirements,and provide a guarantee for the quality stability of different batches of the product.

Elemene;liposome;injection;gas chromatography;fingerprin

R284

：A

：1672-1519（2014）05-0301-05

2013-12-08）

（本文編輯：高 杉，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.17

國家十二五重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2011ZX09201-101-05）。

謝 恬（1961-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑、新技術(shù)、制藥工程、新藥研發(fā)、GMP管理等工作。