頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量測定方法研究

張 燦段樹卿李云霞*

（1 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2 頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德 067000）

頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量測定方法研究

張 燦1,2段樹卿2李云霞2*

（1 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2 頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德 067000）

目的研究頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司獨(dú)家生產(chǎn)幾十年的中藥大復(fù)方制劑-頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量測定方法。方法用HPLC法測定頸復(fù)康顆粒中芍藥的含量，采用C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86）；檢測波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃。結(jié)果 所建立的芍藥苷含量方法，線性范圍為0～0.4896mg/mL，r=0.9999，平均加樣回收率為99.7%，RSD=1.27%（n＝9）。最低檢測限為4.938 ng。結(jié)論 所建立的方法簡便準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，按現(xiàn)行工藝制備的陰性樣品無干擾，專屬性強(qiáng)；通過方法的優(yōu)化，通過不同年份、不同批號的多批數(shù)據(jù)檢測，認(rèn)為可作為頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量測定方法。

頸復(fù)康顆粒；芍藥苷；HPLC；含量測定

頸復(fù)康顆粒是頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)的獨(dú)家品種，由羌活、川芎、葛根、秦艽、威靈仙等21味中藥組成。具有活血通絡(luò)、散風(fēng)止痛的功效，對頸椎病引起的腦供血不足，頭暈，頸項(xiàng)僵硬，肩背酸痛，手臂麻木等癥具有明顯療效，是治療頸椎病的首選藥物[1]。上市二十多年以來，以其確切的療效和明顯的治療特點(diǎn)贏得廣大消費(fèi)者的認(rèn)可，收載于《中國藥典》2010版[2]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有葛根的含量測定及其他幾項(xiàng)薄層鑒別，白芍作為其中的重要藥材，與藥品質(zhì)量有密切關(guān)系。目前市場上白芍的質(zhì)量差異較大，藥材的質(zhì)量必須嚴(yán)格控制，因此控制制劑中芍藥苷的含量很有必要。本研究采用HPLC對頸復(fù)康顆粒中芍藥苷含量進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

安捷倫1100高效液相色譜儀，Agilent HC-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，梅特勒萬分之一分析天平，KQ-500DE型數(shù)控超 聲波清洗儀。

芍藥苷對照品（批號110736-201136）由中國藥品生物制品鑒定所購得，乙腈為色譜純、磷酸為優(yōu)級純，其余為分析純，頸復(fù)康顆粒（批號290843、290844、290845、290846、290847、290855、290909、190628、190706）由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。陰性樣品制備所用藥材經(jīng)頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司工程師、中藥鑒定師商春麗鑒定為正品，均由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，陰性樣品由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18（5μm，4.6 mm×250 mm）柱；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86）；檢測波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇使溶解，并稀釋定容，制成0.05 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品及陰性對照溶液的制備

取頸復(fù)康顆粒，研勻，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，用70%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀? mL溶解，置聚酰胺柱（80-120目，5 g）上，用水100 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇適量使溶解，并定容至10 mL，搖勻即得供試品溶液。按處方中的藥味比例配制不含白芍的陰性樣品，依供試品制備方法制備陰性對照液。

2.4 陰性試驗(yàn)

按上述儀器和試驗(yàn)條件，將芍藥苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液分別進(jìn)樣測定（圖1）。從色譜圖可見，其他成分對芍藥苷的測定無干擾。

圖1 頸復(fù)康顆粒HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取對照品溶液（0.489 6 mg/mL）0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL分別置10 mL量瓶中，用70%乙醇定容，分別取上述溶液10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以芍藥苷的峰面積Y對芍藥苷的濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=12779X-3.7579，r=0.9999（n=6）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0～0.4896 mg/mL，范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、頸復(fù)康顆粒供試品溶液（批號290843）各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次的峰面積。結(jié)果：芍藥苷的峰面積的RSD值分別為0.43%、0.36%。表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 μL，每隔1 h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣8次，記錄每次的峰面積。結(jié)果：芍藥苷峰面積RSD=0.33%（n=8），表明芍藥苷對照品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密吸取供試品溶液（批號290843）10 μL，每隔1 h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣8次，記錄每次的峰面積。結(jié)果：芍藥苷峰面積RSD=0.25%（n=8），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批頸復(fù)康顆粒（批號290843）粉末9份，第1～3份每份0.25 g，第4～6份每份0.5 g，第7～9份每份0.75 g，按供試品的制備方法制成供試液，并按色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測定芍藥苷峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，芍藥苷的平均含量為3.197 mg/g，RSD=1.08%（n=9）。表明芍藥苷該樣品處理方法重現(xiàn)性好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的頸復(fù)康顆粒（批號290843）9份，精密加入芍藥苷對照品適量，按供試品溶液的制備方法分別制備9份樣品，精密吸取10 μL，注入色譜儀。結(jié)果，平均回收率為99.70%，RSD=1.26%，見表1。

2.10 檢測限的確定

將濃度分別為0.004938、0.002469、0.0009876、0.0004938、0.0002469 mg/mL的試樣，按2.4.7的色譜條件，在Agilent1100液相色譜儀進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為10μL，測出試樣濃度為0.0004938 mg/mL溶液的信噪比值為3，確定檢測限為4.938ng。

2.11 定量限的確定

將濃度分別為0.05940、0.005940、0.002376、0.001188 mg/mL的試樣，按2.4.7的色譜條件，在Agilent1100液相色譜儀進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為10 μL，測出試樣濃度為0.001188 mg/mL溶液的信噪比值為10，確定定量限為11.88 ng，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD為1.8%。

2.12 樣品含量測定

取不同批號的頸復(fù)康顆粒，按上述方法測定，結(jié)果見表2。

表2 不同批號頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量

3 討 論

3.1 芍藥苷的含量測定方法報(bào)道比較多，主要是采用高效液相色譜法[3-7]。頸復(fù)康顆粒處方藥味太多，是中國藥典收載的124個(gè)顆粒劑中藥味及處方量之最，成分復(fù)雜。公司技術(shù)人員一直在不斷研究與提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從增加定性鑒別到定量檢測，曾采用薄層掃描法對頸復(fù)康沖劑中芍藥苷的含量進(jìn)行測定[8]，但由于薄層色譜掃描法操作繁瑣，準(zhǔn)確度及精密度相對較差，未得到應(yīng)用。其他含量測定方法[9-11]也存在許多不足，方法重現(xiàn)性差，本研究曾采用不同型號色譜柱考察文獻(xiàn)方法，結(jié)果都未很好的重現(xiàn)出方法結(jié)果，分離度等不符要求。本實(shí)驗(yàn)通過摸索，采用合適的分離條件，成功的對芍藥苷進(jìn)行了分離和純化，建立了高效液相色譜液法對頸復(fù)康顆粒中芍藥苷的含量測定方法。

3.2 本實(shí)驗(yàn)通過對提取溶劑、不同型號色譜柱及流動(dòng)相等的條件考察，確立了最佳方法，并得到了滿意的分離效果。加樣回收率實(shí)驗(yàn)及精密度等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也表明方法可行，準(zhǔn)確度高。用超聲法提取出的成分比較多，直接用液相檢測，采用等度洗脫不易將芍藥苷峰與其他峰有效分離。但如果采用梯度洗脫，數(shù)據(jù)采集時(shí)間變長，考慮到實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)因素，希望能通過改變供試品制備方法來簡化檢測過程。經(jīng)過考察，發(fā)現(xiàn)過聚酰胺柱能有效地將干擾物質(zhì)除去。對聚酰胺用量、洗脫劑用量等進(jìn)行考察，確立了樣品制備方法。

3.3 頸復(fù)康顆粒屬大品種，該品種療效好，市場廣闊，深受患者的好評。對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究與完善提高，既能提高自身的質(zhì)量控制水平，也能對其他大品種制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供借鑒。

[1] 柏泓宇.頸復(fù)康顆粒可有效治療各類型頸椎病[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué),2011,2(9):62.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:1138-1139.

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Study on the Method for the Determination of Paeoniflorin in Jingfukang Granule

ZHANG Can1, DUAN Shu-qing2, LI Yun-xia2
(1 Chengde Medecinal University, Chengde 067000, China; 2 Jingfukang Pharmaceutical Group Co.,Ltd., Chengde 067000, China)

ObjectiveTo study the method for the determination of Paeoniflorin in Jingfukang granule-the Exclusive varieties of Jingfukang Pharmaceutical Group Co.,Ltd.MethodsHPLC was used to determine Paeoniflorin. C18column (5 μm, 4.6 mm×250 mm) was used under the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid (14∶86).The flow rate was 1.0 mL/min,and the detected wavelength was 230 nm.The column temperature was maintained at 25 ℃.ResultsThe linearity of Paeoniflorin was good in the range of 0～0.4896mg/mL,r=0.9999,The average recovery was 99.7% with RSD=1.27%(n=9).The detection limits of Paeoniflorin was 4.938ng.ConclusionThe results show that the method were simple and reproducible. No interference were found in the negative control. It is accurate and reproducible for the determination of Paeoniflorin in Jingfukang granule, with the detection results of different years and batch numbers.

Jingfukang granule; Paeoniflorin; HPLC; Content determination

R284

B

1671-8194（2014）13-0079-02

*通訊作者：E-mail:cdjfk-lyx@163.com