近5年寒凝血瘀證動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

朱成慧，孟向文，樸盛愛(ài)，劉華朋，李丹丹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，天津 300193)

寒凝血瘀證是臨床常見(jiàn)的中醫(yī)證型之一，血瘀由寒邪入于血分而致，多因素體腎陽(yáng)不足，寒邪內(nèi)生，或因常處于寒濕環(huán)境損傷陽(yáng)氣，而致體內(nèi)陽(yáng)氣不足，失其溫煦、推動(dòng)的作用。申松希等[1]根據(jù)寒則凝，凝則成瘀，故寒邪易致寒凝血瘀這一理論，探索了寒凝證模型的制備方法。歷代中醫(yī)文獻(xiàn)對(duì)寒凝血瘀證都有較多的論述，如《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》：“氣血者喜溫而惡寒，寒則泣(澀)而不行，溫則消而去之?！薄吨T病源候論》：“寒則血結(jié)，溫則血消。”近年來(lái)寒凝血瘀證的臨床和實(shí)驗(yàn)研究得到了廣泛關(guān)注，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是探索寒凝血瘀證機(jī)理的一個(gè)主要途徑，越來(lái)越受到廣大醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注，但目前尚無(wú)理想的動(dòng)物模型平臺(tái)，創(chuàng)建和完善穩(wěn)定的、符合臨床的寒凝血瘀證動(dòng)物模型平臺(tái)成為該證型研究的重點(diǎn)工作之一。筆者全面檢索近5年研究寒凝血瘀證動(dòng)物模型的相關(guān)文獻(xiàn)，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、造模方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)、寒凝血瘀證疾病動(dòng)物模型、不同方法對(duì)寒凝血瘀證模型的干預(yù)研究等幾個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)分析。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

如何建立證候動(dòng)物模型，這一問(wèn)題近年來(lái)一直受到人們關(guān)注與探索，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇是能否成功建模的關(guān)鍵因素之一。目前用于建立寒凝血瘀證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要是小鼠和大鼠，也有研究者復(fù)制了兔和小型豬的證候模型。

2 造模方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)

谷萬(wàn)里等[2]在寒凝血瘀證動(dòng)物模型的研究述評(píng)中綜述了近10年關(guān)于寒凝血瘀動(dòng)物模型的報(bào)道，最后總結(jié)出寒凝血瘀證的造模方法可以分為局部?jī)鰝?、全身冷凍法、風(fēng)寒環(huán)境法、冰水浸泡法和冰水浸泡加藥物法等5大類(lèi)。周華妙等[3]進(jìn)一步探索了寒凝血瘀證動(dòng)物模型的制作方法，將BALB/C雌性小鼠采用腎上腺素皮下注射加冰浴法進(jìn)行造模，對(duì)造模前后小鼠進(jìn)行癥狀和體征的評(píng)價(jià)，測(cè)定耳溫及血液流變學(xué)變化等，結(jié)果模型組小鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、蜷縮少動(dòng)、爪尾部紫癜等癥狀，并且耳溫下降，全血黏度增高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，建立了符合中醫(yī)證候特點(diǎn)的寒凝血瘀證小鼠模型。還有研究者對(duì)以往造模方法進(jìn)行了優(yōu)化篩選，如謝波等[4]探討不同冷凍時(shí)間對(duì)寒凝血瘀證動(dòng)物模型建立的影響，將大鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、5 d組、10 d組、15 d組、20 d組，除空白組外，其余大鼠置于0 ℃冰水中15 min，1次/d，各組分別冷凍相應(yīng)天數(shù)，造成寒凝血瘀模型，觀察血常規(guī)、卵巢、子宮指數(shù)和血液流變指標(biāo)，造模10 d和15 d可見(jiàn)大鼠出現(xiàn)凝血功能增強(qiáng)，并且15 d組血液流變學(xué)異常最明顯，從而對(duì)寒凝血瘀證的造模時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。吳銳等[5]選用健康新西蘭種大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，寒凝血瘀模型組動(dòng)物每日浸泡在0～1 ℃冰水中，20 min/d，連續(xù)3周，每兔每日只限飼40 g的高脂高糖飼料，造模3周后模型組動(dòng)物在身體表征、舌象、微循環(huán)、血液流變學(xué)參數(shù)等方面與造模前及對(duì)照組相比有顯著改變，成功復(fù)制了寒凝血瘀證動(dòng)物模型。

馮麟等[6]以中醫(yī)基本理論為指導(dǎo)，將貴州小型豬用失血和冰冷刺激的方法造模，觀察動(dòng)物的體征變化，并檢測(cè)血常規(guī)、血液流變學(xué)、凝血功能、微循環(huán)、超氧化物歧化酶(SOD)、血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列環(huán)素F1α(6-KeTo-PGF1α),結(jié)果模型組動(dòng)物與對(duì)照組動(dòng)物比較，表現(xiàn)出明顯的血瘀體征(如后肢、臀部紅腫青紫，耳唇部青紫,舌青紫、紫暗,脈澀或結(jié)代)，檢測(cè)結(jié)果頁(yè)顯示紅細(xì)胞、血紅蛋白減少，白細(xì)胞、血小板增加，血液黏度和紅細(xì)胞壓積增高，凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、激活部分凝血激酶時(shí)間延長(zhǎng)，纖維蛋白原增加，超氧化物歧化酶和血栓素B2增加，6-酮-前列環(huán)素F1α稍增加，微循環(huán)障礙,臟器組織切片鏡檢結(jié)果表明，模型組動(dòng)物肺臟、肝臟、心臟等水腫、出血、瘀血，成功復(fù)制了血虛寒凝血瘀證的動(dòng)物模型。

寒凝血瘀證模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌鳟?，王永炎院士提出“證候表征模型”概念以及證候模型研究應(yīng)該遵循的因—脈—證—治原則后，引起了學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，研究者都希望找到共同的客觀化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。杜正彩等[7]研究開(kāi)發(fā)出中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證候表征采集分析系統(tǒng)，對(duì)寒凝血瘀證模型大鼠的毛色、眼睛顏色、耳廓顏色、舌色與足爪等多項(xiàng)中醫(yī)證候表征指標(biāo)采集分析，并與檢測(cè)的大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)與微循環(huán)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果模型組大鼠與正常組大鼠在眼睛顏色、耳廓顏色、舌色與足爪顏色的三原色分量值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與肉眼觀察到的癥狀及其他病理指標(biāo)反應(yīng)的病證情況相一致，初步實(shí)現(xiàn)了中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證候表征某些望診指標(biāo)采集的數(shù)字化，分析自動(dòng)化，達(dá)到了客觀、科學(xué)的要求，且實(shí)用性好。

3 寒凝血瘀證疾病動(dòng)物模型的建立

基于此證型動(dòng)物模型的疾病主要有原發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔炎、消化性潰瘍、心肌缺血等。盧阿娜等[8]將36只大鼠切除背部棕色脂肪7 d后，丙硫氧嘧啶連續(xù)灌胃42 d，術(shù)后21 d開(kāi)始雌激素連續(xù)灌胃28 d，成功地建立了原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證的大鼠模型。葉秋香等[9]采用苯酚膠漿法疊加冰浴法建立了病證結(jié)合的寒凝血瘀證慢性盆腔炎大鼠模型。吳卓霖等[10]用改良寒冷暴露及吲哚辛法建立寒凝血瘀證型胃潰瘍大鼠模型，并認(rèn)為此方法建立的模型符合中醫(yī)證候及消化性潰瘍“病癥結(jié)合”的特點(diǎn)。谷萬(wàn)里等[11]將大鼠置于(-5±1) ℃環(huán)境中連續(xù)3 h,然后再恢復(fù)(20±1) ℃室溫，并給予垂體后葉素20 U/(kg·d)腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d，結(jié)果模型組大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、蜷縮少動(dòng)、爪尾部紫等癥狀；檢測(cè)結(jié)果示血清FT3、FT4、TSH降低，血漿ET升高，NO降低,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，給硝酸甘油治療后上述情況明顯改善，成功造成符合中醫(yī)證侯特點(diǎn)的寒凝血瘀心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

4 不同干預(yù)方法對(duì)寒凝血瘀證模型的實(shí)驗(yàn)研究

目前關(guān)于寒凝血瘀證干預(yù)方法的實(shí)驗(yàn)報(bào)道主要是活血化瘀藥物和艾灸，通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型相關(guān)指標(biāo)的影響來(lái)探討其作用機(jī)制，尚未發(fā)現(xiàn)針刺及拔罐對(duì)寒凝血瘀證的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。如孟憲生等[12]通過(guò)代謝組學(xué)研究方法，尋找大鼠寒凝證潛在的生物標(biāo)志物，研究熱性中藥川芎對(duì)其潛在生物標(biāo)志物的影響，探討川芎治療寒凝證的作用機(jī)制，根據(jù)寒凝證的臨床表現(xiàn)，制造寒凝血瘀大鼠模型，利用UPLC/Q-TOFMSBPI離子流圖譜，分別繪制空白組、血瘀模型組、川芎大小劑量給藥組的血漿BPI離子流指紋圖譜,對(duì)圖譜中分子離子峰進(jìn)行分析，通過(guò)Markerlynx軟件進(jìn)行色譜峰自動(dòng)識(shí)別和峰匹配,采用主成分分析法(PCA)對(duì)不同組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別，從而找到寒凝血瘀證潛在生物標(biāo)志物及藥物的作用靶點(diǎn)，闡明其作用機(jī)制，認(rèn)為熱性藥川芎對(duì)寒凝血瘀證大鼠的作用機(jī)制，可能是通過(guò)抑制使磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為花生四烯酸的磷脂酶A2，使血栓烷的合成水平降低，影響磷脂酰膽堿代謝途徑，使血瘀癥狀減輕而發(fā)揮治療作用的。又如陳思宇等[13]探討艾灸治療寒凝血瘀證模型大鼠的活血化瘀作用機(jī)制，將健康雄性SD大鼠用低溫冷凍法建立大鼠寒凝血瘀證模型，并用艾灸進(jìn)行治療，治療完成日上午腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)內(nèi)皮素和一氧化氮含量，認(rèn)為膈俞、血海的活血化瘀作用是通過(guò)降低ET、升高NO實(shí)現(xiàn)的，委中、丘墟的活血化瘀作用是通過(guò)降低ET實(shí)現(xiàn)的，表明艾灸膈俞、血海、委中、丘墟有活血化瘀作用。

5 討論

寒凝血瘀證模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要是小鼠和大鼠，比較單一，近年來(lái)逐步擴(kuò)展到兔和小型豬等相對(duì)大型動(dòng)物，增加了該證型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多樣性，促進(jìn)了針刺、拔罐等干預(yù)方法實(shí)驗(yàn)研究的可行性，但兔與小型豬的模型尚不穩(wěn)定，有待今后相關(guān)研究的反復(fù)驗(yàn)證。造模方法在以往的造模方法基礎(chǔ)上有所改進(jìn)，更加注重中醫(yī)證候特點(diǎn)，并對(duì)造模時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化，但尚無(wú)理想的動(dòng)物模型平臺(tái)，今后應(yīng)針對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)一步對(duì)造模方法和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。寒凝血瘀證的機(jī)理研究由血液指標(biāo)檢測(cè)和圖像采集逐步拓展到分子生物學(xué)領(lǐng)域和圖像的量化分析，但相關(guān)指標(biāo)不系統(tǒng)，機(jī)理研究尚不深入。張棟等[14]認(rèn)為今后中醫(yī)證候動(dòng)物模型復(fù)制應(yīng)以中醫(yī)理論為核心，以辨證論治為基礎(chǔ)，臟腑理論為依據(jù)，病因病機(jī)為準(zhǔn)則。筆者認(rèn)為中醫(yī)證候研究不應(yīng)局限于指標(biāo)的改變，更應(yīng)注重的是指標(biāo)的生物學(xué)意義。目前寒凝血瘀證的干預(yù)方法局限于藥物和艾灸，今后應(yīng)建立穩(wěn)定的寒凝血瘀模型平臺(tái)，以開(kāi)展針刺和拔罐等中醫(yī)療法的研究，將中醫(yī)證候和臨床實(shí)際相結(jié)合，進(jìn)一步揭示寒凝血瘀證的機(jī)制，從而為寒凝血瘀證的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

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