銅綠假單胞菌外膜蛋白D2與亞胺培南耐藥關(guān)系的研究＊

閆玉蘭，郭世輝，李 萌，吳曉寧，梁宏潔（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021）

銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，常對多種抗菌藥物天然耐藥，碳青霉烯類藥物[亞胺培南、美羅培南等]是臨床用于治療銅綠假單胞菌感染的常用抗菌藥物。然而，隨著碳青霉烯類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對此類藥物的耐藥率也明顯升高。有文獻(xiàn)報(bào)道銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥主要是由胞壁屏障機(jī)制所致，由碳青霉烯酶所致的耐藥只占極少部分[1]?，F(xiàn)將廣西地區(qū)銅綠假單胞菌中外膜蛋白D2（OprD2）的缺失與亞胺培南耐藥之間的關(guān)系分析報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇2011年6月至2012年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院各科住院患者的各類臨床標(biāo)本。同一患者分離得到的菌株不重復(fù)計(jì)入。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑 水解酪蛋白（MH）瓊脂粉（杭州天和微生物試劑有限公司）；抗菌藥物亞胺培南粉劑（美國默沙東制藥公司）；細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒購于上海炎彬公司，蛋白marker購于TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司，考馬斯亮藍(lán)快速染色液購于上海雙螺旋生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 VITEK 2和ATB鑒定儀（法國梅里埃公司），MINI垂直電泳槽、恒壓恒流電泳儀、凝膠成像分析儀（Bio－Rad公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌株鑒定 用梅里埃的VITEK－2和ATB鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.4.2 耐藥菌株的篩選 參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)，用瓊脂平皿二倍稀釋法測定銅綠假單胞菌對亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）值，MIC≥8為耐藥。

1.4.3 水楊酸鹽抑制實(shí)驗(yàn)[2－3]將對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌株分別接種于含有和不含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上，再將亞胺培南藥敏紙片分別貼在兩個(gè)平板上，將平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察亞胺培南抑菌圈的大小。

1.4.4 外膜蛋白的提取與制備 根據(jù)試劑盒里的說明書提取細(xì)菌的膜蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白配制成5.0mg／mL的濃度，并于－80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 蛋白質(zhì)電泳 將蛋白樣品與樣品緩沖液以4∶1的比例混勻，100℃加熱5min以使蛋白質(zhì)變性。通過SDS－PAGE電泳（分離膠濃度為10%）分離外膜蛋白，電泳時(shí)濃縮膠的電壓為80V，分離膠的電壓為120V。然后用考馬斯亮藍(lán)快速染液染色、脫色，并用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4.6 外膜蛋白位置的確定 將上述在含和不含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上生長的對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌分別轉(zhuǎn)種到肉湯培養(yǎng)基中，水浴震蕩過夜。提取細(xì)菌的外膜蛋白并SDS－PAGE電泳。利用銅綠假單胞菌OprD2能被水楊酸鹽抑制的特性[4]以確定外膜蛋白的位置。

2 結(jié) 果

2.1 銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥情況 共檢出亞胺培南耐藥株106株，其對亞胺培南的MIC值均大于或等于16μg／mL；30株亞胺培南敏感株的MIC值均小于或等于2μg／mL。

2.2 水楊酸鹽抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌，在含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上生長，亞胺培南抑菌圈直徑小于或等于12mm，即對亞胺培南耐藥；而在不含水楊酸鈉MH平板上生長的亞胺培南的抑菌圈直徑大于25mm，即對亞胺培南敏感。

2.3 外膜蛋白位置的確定 在含水楊酸鈉平板上生長的菌株不表達(dá)OprD2（即OprD2蛋白缺失），生長在不含水楊酸鈉平板上的菌株則表達(dá)OprD2蛋白（即OprD2蛋白不缺失），可由此確定銅綠假單胞菌的OprD2的位置。

2.4 SDS－PAGE凝膠電泳結(jié)果 銅綠假單胞菌ATCC27853及亞胺培南敏感株均在45×103處出現(xiàn)了OprD2蛋白條帶，在106株亞胺培南耐藥菌中，有99株在45×103處未出現(xiàn)OprD2蛋白條帶，缺失率為86.8%，其余7株亞胺培南耐藥株未出現(xiàn)OprD2的缺失。

3 討 論

銅綠假單胞菌細(xì)胞壁兩側(cè)有內(nèi)、外兩層膜，其外膜蛋白本身的通透性不高，缺乏其他多數(shù)革蘭陰性菌具有的“典型”高通透性孔蛋白，僅存在著低通透性微孔蛋白形成的小孔道，只允許小分子親水性物質(zhì)跨膜擴(kuò)散，對進(jìn)入菌體的藥物具有選擇性，因此外膜結(jié)構(gòu)在抗菌藥物耐藥中擔(dān)任重要的角色[4]。銅綠假單胞菌有多種外膜蛋白，其中OprC（70×103）、OprD2（45×103）、OprE（43×103）均有孔道活性，其中外膜孔蛋白OprD2孔道被認(rèn)為是小分子碳青霉烯類藥物選擇性快速進(jìn)入菌體的特異性通道[5]。

以亞胺培南為代表的碳青霉烯類藥物是目前臨床用于治療銅綠假單胞菌感染應(yīng)用最廣也是效果最好的藥物之一，亞胺培南藥物是以細(xì)菌內(nèi)膜上的青霉素結(jié)合蛋白PBP－2及PBP－3為作用靶位的，但藥物必須要通過細(xì)菌的外膜才能到達(dá)作用靶位，而OprD2是亞胺培南進(jìn)入細(xì)菌的特異性通道[6]，編碼OprD2的結(jié)構(gòu)基因OprD位于染色體上，編碼基因OprD的突變可使OprD2蛋白表達(dá)減少甚至缺失，所以當(dāng)OprD2缺失或表達(dá)減少時(shí)可導(dǎo)致菌體外膜通透性改變從而使得碳青霉烯類藥物進(jìn)入菌體受到阻礙，在臨床上表現(xiàn)為銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥。除此以外，OprD2還能形成碳青霉烯類藥物特異性結(jié)合位點(diǎn)，是目前所知的銅綠假單胞菌中唯一有助于抗菌藥物通過的孔道蛋白[7]。因此，外膜蛋白OprD2缺失是介導(dǎo)銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機(jī)制之一[8]。而β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物如青霉素或頭孢菌素的作用機(jī)制是通過抑制胞壁黏肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），從而阻礙細(xì)胞壁黏肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。多數(shù)青霉素類或頭孢菌素類抗菌藥物主要與PBP1和（或）PBPs結(jié)合，形成絲狀體和球形體，使細(xì)菌發(fā)生變形萎縮，逐漸溶解死亡[9]。即β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物如青霉素和頭孢菌素等不能通過OprD2，因此，以亞胺培南為代表的碳青霉烯類藥物與β－內(nèi)酰胺類藥物無交叉耐藥性[10－11]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，106株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中，99株OprD2缺失，缺失率為86.8%，由此可推斷OprD2的缺失在介導(dǎo)本院銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥中起著重要的作用。其余7株亞胺培南耐藥株未出現(xiàn)OprD2的缺失，說明介導(dǎo)銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的還有其他的機(jī)制，如產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶[12]、主動外排泵的存在等[13－14]。本次研究中，OprD2的缺失率為86.8%，這與顏英俊等[15]對34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌臨床標(biāo)本用PCR方法擴(kuò)增OprD基因并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA分析后發(fā)現(xiàn)，對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的OprD基因突變率達(dá)高92.3%的研究結(jié)果相似。顏英俊等的研究還發(fā)現(xiàn)OprD基因突變的方式主要有點(diǎn)突變、缺失突變以及插入突變等。細(xì)菌因發(fā)生基因突變而引起OprD莖環(huán)結(jié)構(gòu)L2、L3和亞胺培南藥物主要結(jié)合位點(diǎn)氨基酸發(fā)生替換和移位突變，最終導(dǎo)致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥[16]。國外也有與顏英俊類似的報(bào)道，如Yoneyama等[17]研究發(fā)現(xiàn)，OprD2基因缺失存在缺失突變，編碼區(qū)DNA片段發(fā)生缺失，導(dǎo)致移位突變，并形成1個(gè)位置提前的新終止密碼子進(jìn)而引起其肽鏈異常，最終導(dǎo)致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥[18]。這說明OprD2的缺失是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥的重要機(jī)制之一。

本研究OprD2缺失率為86.8%，而2010年哈爾濱地區(qū)的OprD2缺失率為26.19%（42株耐亞胺培南菌株中11株完全缺失）[11]，2007年北京一所醫(yī)院的OprD2缺失率為56.10%[19]，這與本研究的OprD2缺失率有差異，可能是地區(qū)不同而導(dǎo)致的差異或研究的年份不同而導(dǎo)致的差異。本研究只是針對廣西地區(qū)耐亞胺培南的銅綠假單胞菌進(jìn)行耐藥機(jī)制的研究，對OprD2的缺失僅作了定性分析，OprD2的表達(dá)量與銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥程度之間的關(guān)系有待作進(jìn)一步研究。

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