TLR3對細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的調(diào)控

高小姣，陳 莉

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科，江蘇南通226001)

Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，迄今為止，在人體中發(fā)現(xiàn)11 種TLRs［1］。TLRs 家族是物種進(jìn)化過程中的一個保守家族，每個TLR 成員都是模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)［2］，能夠識別某種高度保守的結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，在固有免疫反應(yīng)對抗病原微生物，如在細(xì)菌，原蟲，真菌或病毒中發(fā)揮核心作用。

Toll 樣受體3(toll like receptor 3，TLR3)是TLR家族中的重要成員，它識別雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)。dsRNA 既可來源于微生物復(fù)制中間產(chǎn)物，也可來源于壞死或凋亡細(xì)胞。近期研究表明，TLR3 其配體，一種病毒dsRNA 的合成類似物聚肌苷酸聚胞嘧啶核苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，PolyI:C)，通過激活TLR3 可以影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能［6］，特別是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長。

1 TLR3 分子的概述

1.1 TLR3 分子的結(jié)構(gòu)

人TLR3 基因由15 944 個核苷酸組成，包含5個外顯子組成，編碼含有904 個氨基酸蛋白，相對分子質(zhì)量為125 000 Κα。TLR3 同所有的Toll 樣受體一樣，都是Ⅰ型跨膜蛋白受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)主要行使識別受體及與其他輔助受體(co-receptor)結(jié)合形成受體復(fù)合物的功能;跨膜區(qū)由21 個氨基酸(705-725)組成，含有大量半胱氨酸;胞內(nèi)區(qū)為含丙氨酸殘基的Toll 同源結(jié)構(gòu)域(TH domain)，該結(jié)構(gòu)域和白介素1 受體(interlukin-1 receptor，IL-1R)高度同源，故也被稱為Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域(toll/IL-1 receptor domain，TIR 結(jié)構(gòu)域)，TIR 具有嗜同性相互作用(homophilic interaction)，借此來募集下游含有TIR 的信號分子，組成信號復(fù)合體，參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。

1.2 TLR3 分子調(diào)節(jié)的信號通路

TLR3 通過依賴誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β 的含TIR 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein including IFN-β，TRIF，又名TIR-domain-containing molecule 1，TICAM1)，即所謂的TRIF 途徑［3］。TRIF激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和招募TANK 結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase1，TBK1)來激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)，最終導(dǎo)致IFN-β 產(chǎn)生［4］。已知NF-κB家簇5 個成員分別是NF-κB 1(P50/ P105)、NF-κB 2 (P52/P100)、C-REL、RELA (P65)和 RELB(I-REL)，研究發(fā)現(xiàn)在人纖維肉瘤細(xì)胞系(HT1080)中存在dsRNA 介導(dǎo)的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)TLR3 激活兩條通路，并且發(fā)現(xiàn)兩條通路通過不同的NF-κB 成員起作用;在細(xì)胞外通路中NF-κB 成員RELA 對IFN-β和其他細(xì)胞因子的調(diào)控作用是有限的，而NF-κB成員RELB 起負(fù)調(diào)控作用。相反，細(xì)胞內(nèi)的dsRNA 信號是依賴RELA，而非RELB［5］。

2 TLR3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用

與TLR3 在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子不同，TLR3 信號在癌細(xì)胞中明顯偏向通過多條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12，15］。這種誘導(dǎo)凋亡可能是癌細(xì)胞對PolyI:C 或dsRNAs 處理高敏感性的原故。

2.1 TLR3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用

在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721 中，PolyI:C 和三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)聯(lián)合使用通過TLR3激活和線粒體通路協(xié)同觸發(fā)凋亡，PolyI:C 以劑量依賴形式誘導(dǎo)TLR3，TRIF 過表達(dá)和casepase-8 激活及Bcl-2 下調(diào)，Bax 上調(diào)來促進(jìn)凋亡［6］。肝癌中TLR3高表達(dá)與患者長期生存呈正相關(guān)，并引起NK 細(xì)胞增生及增加NK 細(xì)胞的抗腫瘤活性［7］。這些結(jié)果表明TLR3 對凋亡作用是必須的。

在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，dsRNA 抑制瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)凋亡，并且在高表達(dá)TLR3 的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-AS)中dsRNA 引起生長抑制和促凋亡作用更明顯，TLR3-PKR-IRF3-caspase-3 參與此作用［8］。PolyI:C 能誘導(dǎo)SK-N-AS 細(xì)胞中casepase-3、casepase-8 和casepase-9 的激活，但是內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體途徑)優(yōu)先參與PolyI:C 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能抑制劑bafilomycin A1 可以有效地阻斷casepase-3、casepase-8 和casepase-9 激活，提示在SK-N-AS 細(xì)胞中TLR3 可能存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［9］。不僅如此，在SK-N-AS 細(xì)胞中，PolyI:C 激活TLR3有效地抑制細(xì)胞遷移和侵襲并且減少微絲組裝和絲狀偽足形成，TLR3 陽性表達(dá)和良好的組織和預(yù)后有關(guān)［10］。PolyI:C 也可通過抑制sonic Hedgehog(Shh)信號來負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NPC)增生，還可以誘導(dǎo)NPC 凋亡，凋亡與Ras-ERK信號的抑制和Fas 的高表達(dá)有關(guān)，提示Shh 和TLR3通路之間有信號匯聚［11］。

在轉(zhuǎn)移性頭頸癌細(xì)胞中，dsRNA 處理后細(xì)胞凋亡顯著增加，并依賴于TLR3 及其效應(yīng)蛋白TRIF 和NF-κB 信號的減少，該結(jié)果首次表明遷移細(xì)胞對dsRNA-TLR3 介導(dǎo)的凋亡特殊敏感［12］。在體外口腔鱗癌細(xì)胞中，PolyI:C 主要通過TLR3 激活增加IRF3 磷酸化，產(chǎn)生IFN-β 和激活casepase-3 及casepase-9 來誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡;同樣在口腔鱗癌異種移植小鼠模型中也證實TLR3 激活能抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌生長［13］。并且，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，PolyI:C 能夠提高紫杉醇的抑制效果［14］。

2.2 TLR3 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用

內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)參與血管形成，在血管修復(fù)中發(fā)揮作用。EPCs 表達(dá)高水平功能性TLR3，PolyI:C 處理EPCs可激活TLR3，通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來減少EPCs 細(xì)胞的增生［15］。所以TLR3 促進(jìn)EPCs 凋亡或許是其激動劑是治療腫瘤的機(jī)制之一。也有研究表明dsRNA 促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的凋亡并且抑制HUVEC 形成血管［16］。在人和鼠視網(wǎng)膜色素上皮新生血管中，采用人工合成的dsRNA 或PolyI:C 激活TLR3 可以誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而在TRIF － / －小鼠中，PolyI:C 誘導(dǎo)的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯減少，表明TLR3 和TRIF 參與PolyI:C 誘導(dǎo)的凋亡［17］。但是，滋養(yǎng)細(xì)胞中TLR3 信號通路激活誘導(dǎo)可溶性fms 樣酪氨酸激酶(sFlt-1)表達(dá)，抑制PlGF 表達(dá)，導(dǎo)致血管生成障礙，可能參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生［18］。

2.3 TLR3 誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡作用

在人體內(nèi)凋亡機(jī)制對于對免疫活性細(xì)胞的動態(tài)平衡十分重要。PolyI:C 不僅在體內(nèi)可以誘導(dǎo)DC凋亡，在體外同樣可以誘導(dǎo)DC 凋亡［19］，以免DC 壽命過長而產(chǎn)生自身免疫。Ⅰ型INF 的產(chǎn)生對PolyI:C 誘導(dǎo)的體內(nèi)DC 凋亡具有重要的作用，在這個過程中需要多種蛋白參與，包括Bim、Puma、Noxa 或Bid 等。巨噬細(xì)胞是表達(dá)蛋白酶最高的細(xì)胞，并且在慢性炎性疾病中是炎性和組織損傷的主要促進(jìn)劑，TLR3 促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡可能會減輕慢性炎性疾病的發(fā)展［20］。

3 TLR3 激活對細(xì)胞自噬的影響

自噬(autophagy)作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是真核細(xì)胞中一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象，其主要作用是清除和降解自身受損的細(xì)胞器以及多余的生物大分子，并利用降解產(chǎn)物提供能量和重建細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生命活動等方面起重要作用。PolyI:C 處理人前列腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡中同時升高Ⅰ型和Ⅱ型微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，Map1LC3)表達(dá)。反之當(dāng)?shù)蛲霰灰种茣r，由PolyI:C誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞自噬仍可以持續(xù)和/或增強(qiáng)。而且自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)也可以促進(jìn)PolyI:C 誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡［21］。β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domaincontaining adaptor protein including IFN-β，TRIF)與點狀亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的LC3 至少部分共定位，泛素蛋白1(ubiquilin 1 or PLIC-1)通過減少自噬途徑中信號銜接分子TRIF 來實現(xiàn)對TLR3-TRIF 信號通路的抑制，這些結(jié)果表明自噬并不是TLR3 激活的結(jié)果，而是TLR3 信號通路的交談作用或旁路步驟發(fā)揮的作用［22］。

4 問題與展望

抗微生物肽LL37 是唯一已知的人類抗菌肽家族成員，在外周血單核細(xì)胞中，LL37 提高PolyI:C 以TLR3 依賴方式誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)，在人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS2B)中，LL37 也與dsRNA 和TLR3 共定位，在體外，LL37 與dsRNA 形成復(fù)合體并且改變dsRNA 的構(gòu)象，潛在促進(jìn)其識別TLR3［23］。在病毒感染的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)酶ADAR-1 的激活引起含有次黃嘌呤的RNA(Ino-RNA)出現(xiàn)，SS-Ino-RNA 是一種新的病毒識別原件，它通過TLR3 發(fā)揮抗病毒作用，它是一個還沒有記載的病毒相關(guān)先天免疫刺激;含高次黃嘌呤的RNA 在正常生長的真核細(xì)胞中通常不被發(fā)現(xiàn)，但在DNA 和RNA 病毒感染期間會出現(xiàn)［24］。

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，細(xì)胞自噬的作用具有雙向性，一方面細(xì)胞自噬防止有毒或致癌的損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，抑制細(xì)胞癌變;另一方面自噬亦可通過限制壞死和炎性反應(yīng)促使腫瘤細(xì)胞存活于代謝性應(yīng)激或免疫抑制中，促進(jìn)腫瘤生長［25］。PolyI:C 既可誘導(dǎo)凋亡又可促進(jìn)自噬，自噬和凋亡之間又有著復(fù)雜的關(guān)系［21-23］，TLR3 對細(xì)胞增生又存在雙重效果，有可能促進(jìn)，有可能抑制，所以，對PolyI:C 作用于癌癥的機(jī)制及最終結(jié)果的研究十分重要。另外，近年來siRNA 用于實驗研究得到了廣泛關(guān)注，siRNA 也是一種dsRNA，有可能激活TLR3，產(chǎn)生干擾素效應(yīng)，所以要排除此影響。

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