皖北地區(qū)楊樹葉銹病病原鑒定與發(fā)生規(guī)律的初步研究

宋敏，洪少民，常廣榮，張明，李珂，孫翀，任德珠

（1.蚌埠市森防站，安徽蚌埠 233000；2.懷遠(yuǎn)縣林業(yè)局）

皖北地區(qū)楊樹葉銹病病原鑒定與發(fā)生規(guī)律的初步研究

宋敏1，洪少民2，常廣榮1，張明2，李珂1，孫翀1，任德珠1

（1.蚌埠市森防站，安徽蚌埠 233000；2.懷遠(yuǎn)縣林業(yè)局）

本文對楊樹葉銹病在皖北地區(qū)的發(fā)病特點、病原菌形態(tài)進行了初步研究，分析了銹病發(fā)生與品種、林地管理、降水和濕度等因素的關(guān)系，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)分類技術(shù)將病原菌鑒定為落葉松-楊柵銹菌。研究表明，楊樹葉銹病在皖北地區(qū)一年只有秋季一次高發(fā)期；銹病的發(fā)生與多種因素關(guān)系密切；在無轉(zhuǎn)主寄主的情況下可以連年危害。

楊樹葉銹??；落葉松-楊柵銹菌；病原鑒定；皖北地區(qū)

楊樹作為重要的速生用材和防護林樹種，易繁殖、生長快、效益高、適生性強，是皖北地區(qū)最主要的造林樹種之一。在我國，楊樹是東北、西北、華北和西南地區(qū)用材林、防護林、薪炭林以及“四旁”綠化的重要樹種[1]。隨著安徽省綠色長廊、退耕還林、長防林等重點工程項目的實施，皖北楊樹種植規(guī)模逐年擴大，僅蚌埠市楊樹面積就達7.6萬hm2，楊樹活立木蓄積量約450萬m3，楊樹在本地區(qū)生態(tài)建設(shè)、地方經(jīng)濟發(fā)展和林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用。隨著楊樹資源的擴增，近年來本地區(qū)楊樹葉銹病普遍發(fā)生并愈來愈嚴(yán)重。國內(nèi)對楊樹葉銹病的研究主要集中在胡楊銹病、新疆楊銹病、落葉松楊柵銹病等北方地區(qū)發(fā)生的楊樹銹病[2-3]。鑒于楊樹葉銹病在皖北地區(qū)的發(fā)生侵染規(guī)律尚不清楚，病原菌種類不明確，為此，本文對楊樹葉銹病在本地區(qū)的發(fā)生規(guī)律、病原菌種類等進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 研究地點和材料

研究地點位于安徽省蚌埠市楊樹葉銹病發(fā)生區(qū)。蚌埠市地處安徽省北部、淮北平原南端。116°45′～118°04′E，32°43′～33°30′N，淮河自西向東過境。北亞熱帶和暖溫帶的過渡帶，氣候溫和，四季分明，光、熱充足，年平均日照時數(shù)≥2 200 h，年平均氣溫15.4℃，≥10℃積溫4 813℃。多年平均無霜期218 d，平均初霜期11月2日，終霜期3月28日。年均降雨量905.4mm，降水主要分布在夏季，6～8月份降水量約占全年的49%。

楊樹葉銹病病原菌鑒定樣品來自本地感染楊樹葉銹病的病葉。

1.2 研究方法

1.2.1 病情監(jiān)測與發(fā)病規(guī)律調(diào)查

2011年～2013年，每年5月、7月、9月～10月在全市范圍各開展楊樹葉銹病專項普查一次，實施動態(tài)監(jiān)測。選擇銹病發(fā)生較普遍和嚴(yán)重的地塊，根據(jù)楊樹品種、林齡、郁閉度、管理狀況不同，設(shè)立20個固定監(jiān)測樣地，40個臨時監(jiān)測樣地，分品種、林地管理水平等因素定期調(diào)查病情。在樣地內(nèi)隨機選擇50株楊樹標(biāo)準(zhǔn)株，從樣株表現(xiàn)初始癥狀開始，每隔15 d調(diào)查一次發(fā)病程度。按分級計數(shù)法計算病情指數(shù)（分級標(biāo)準(zhǔn)見表1）。同期同步進行氣象數(shù)據(jù)采集并記錄。通過踏查和標(biāo)準(zhǔn)地調(diào)查，綜合分析楊樹葉銹病的發(fā)生與楊樹品種、降水、郁閉度、管理狀況的相關(guān)性，總結(jié)楊樹葉銹病發(fā)病規(guī)律、特點。1.2.2楊樹葉銹病病原形態(tài)鑒定

表1 楊樹葉銹病分級標(biāo)準(zhǔn)

2012年9月、11月，從發(fā)生區(qū)林地采集楊樹葉銹病病葉樣品，用徒手切片法制作組織樣片，在高倍顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)，在顯微鏡下測量30個夏孢子大小，進行初步鑒定。

1.2.3 楊樹葉銹病病原分子生物學(xué)鑒定

（1）菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA（下簡稱ITS）區(qū)域的擴增。采用DNA提取試劑盒制備楊樹葉銹病原菌基因組DNA，擴增引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），采用聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)（PCR）獲得病原菌的ITS區(qū)基因片段[4]，見表2。

表2 PCR擴增體系

擴增反應(yīng)在Eppenddorf AG22331 PCR儀上進行。

擴增程序：94℃變性5min，（94℃變性1 min，52℃退火1min，72℃延伸1min）×30，72℃延伸10 min，4℃保溫。取5μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物序列交由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測定。

（2）分子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。為研究供試菌株與已知柵銹菌的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，在GenBank上下載相關(guān)近緣種酵母菌菌株的ITS rDNA區(qū)域序列與供試菌株的序列放在一起，用BioEdit軟件進行匹配排列，使用MEGA4.1軟件，并采用Neighbor-Jioning方法構(gòu)建分支系統(tǒng)樹和Bootstrap analysis方法進行1 000次重復(fù)抽樣分析[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹葉銹病病原物形態(tài)觀察與鑒定

2.1.1 病菌孢子形態(tài)

（1）夏孢子形態(tài)。楊樹葉銹病夏孢子堆初期主要生于葉的背面。初期葉背面生長少量黃色丘疹狀斑點，后葉表皮破裂散放出橘黃色粉狀物，為夏孢子堆。嚴(yán)重發(fā)病時黃粉布滿整個葉背面，影響光合作用，加之葉表皮破裂使葉片大量失水，導(dǎo)致葉片焦枯，提前落葉，降低林木生長量，影響生態(tài)和景觀。顯微鏡下觀察（表3），夏孢子單胞；淡黃色或晶白色；圓形、橢圓或卵形；大?。?8～40）μm×（19.6～25）μm；孢子壁在“赤道處”略微加厚；表面有較少的疣狀刺。

表3 顯微鏡下觀察夏孢子大小及形狀（摘錄）

（2）冬孢子堆形態(tài)。11月中下旬在葉正面出現(xiàn)棕褐色、呈痂疤狀的病癥，為冬孢子堆，冬孢子堆生于葉表皮下。

2.1.2 病菌形態(tài)分類鑒定

目前，對于楊樹葉銹菌的分類，主要是以夏孢子的形狀、大小、壁厚的均勻度、表面小刺的形狀和分布、側(cè)絲以及冬孢子形態(tài)、其在葉面的著生部位作為分類依據(jù)。本文將采集的楊樹葉銹病病原菌鑒別形態(tài)與國內(nèi)外已報道的楊樹葉銹病病原菌特征進行比照分析，根據(jù)檢索表（表4）初步鑒別蚌埠楊樹葉銹病病原菌與落葉松-楊柵銹菌（Melampsoralarici-populinaKleb.）較為一致。

表4 常見楊樹葉銹病檢索表

2.1.3 原菌分子分類鑒定結(jié)果

采用DNA提取試劑盒制備基因組DNA，通過PCR擴增法得到該病原菌的ITS區(qū)基因片段，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，如圖1所示，長度約700 bp。

圖1 銹病病原ITS rDNA序列PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

楊樹葉銹病病原菌的ITS區(qū)序列長度為684 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索（BLAST search），結(jié)果顯示，該病原菌和落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）（GenBank No. JQ912668）的ITS區(qū)序列相似性為100%。從GenBank下載相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖2中可以看出該病原菌和落葉松-楊柵銹菌聚在一組，自舉支持率100%，和馬格柵銹菌（Melampsora magnusiana）相距甚遠(yuǎn)。因此，綜合楊樹葉銹病病原菌的形態(tài)、孢子和ITS rDNA序列把該菌鑒定為落葉松-楊柵銹菌。

圖2 柵銹菌屬部分菌株的ITS區(qū)域分支系統(tǒng)樹

2.2 楊樹葉銹病的發(fā)生規(guī)律

2.2.1 病害與轉(zhuǎn)主寄主的關(guān)系

本地區(qū)楊樹葉銹病的病原菌鑒定為落葉松-楊柵銹菌，而本地區(qū)遠(yuǎn)離落葉松林。對于楊樹葉銹病沒有轉(zhuǎn)主寄主仍能連年危害的現(xiàn)象以往已有研究報道。有作者認(rèn)為，落葉松-楊柵銹菌在落葉松不能生長的溫暖地方，可以夏孢子越冬，夏孢子的存活力和致病性在干燥情況下可達10個月之久，在越冬后仍有致病性，因此即使沒有轉(zhuǎn)主，該菌也能以夏孢子越冬連續(xù)為害[3]。

2.2.2 病害與降水及濕度的關(guān)系

根據(jù)調(diào)查，密度大、通風(fēng)透光不良的林分，空氣相對濕度高，發(fā)病早而重；反之則發(fā)病晚而輕。2011年10月份調(diào)查，11塊郁閉度0.6以上的標(biāo)準(zhǔn)地，平均病情指數(shù)60.6；同期8塊郁閉度0.5以下的標(biāo)準(zhǔn)地，平均病情指數(shù)36.8。

根據(jù)調(diào)查，楊樹葉銹病發(fā)病程度與夏季降水時長關(guān)系密切。2011年7～8月，陰雨時間陸續(xù)長達48 d（其余14 d為多云天氣），10月上旬楊樹葉銹病病情指數(shù)平均50.4；2012年7～8月調(diào)查區(qū)干旱少雨，陰雨時間僅26 d（其余36 d為多云或晴天），10月上旬銹病病情指數(shù)平均32.6，發(fā)生相對2011年同期較輕。

2.2.3 病害與楊樹品種的關(guān)系

連續(xù)3年的監(jiān)測調(diào)查發(fā)現(xiàn)，相似的氣候因素和立地條件下，楊樹品種不同，發(fā)生楊樹葉銹病的情況差異較大。調(diào)查顯示，107楊感病不明顯，癥狀輕微；中林46楊在本地區(qū)通常從8月初開始出現(xiàn)黑斑病害并逐漸落葉，發(fā)病高峰期先于葉銹病，較少發(fā)現(xiàn)銹病危害；近年繁育推廣的彩葉品種紅葉楊（2025楊芽變品種）目前處于苗期及幼林階段，未發(fā)現(xiàn)葉銹病癥狀，表現(xiàn)出較強的抗性；I-69楊在本地表現(xiàn)易感染銹病，且部分區(qū)域感病嚴(yán)重。在調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)I-69楊樹葉片上有白粉病發(fā)生時，白粉病發(fā)病區(qū)域不會出現(xiàn)葉銹菌夏孢子堆，同樣葉銹病發(fā)病區(qū)域也不會出現(xiàn)白粉菌孢子堆，常在一個葉片上可同時見到?jīng)芪挤置鞯陌追鄄“l(fā)病區(qū)域和葉銹病發(fā)病區(qū)域，似乎不同病菌孢子具有排他特性，這種現(xiàn)象有待進一步研究。

2.2.4 病害與楊樹葉片距地面高度的關(guān)系

根據(jù)調(diào)查，本地區(qū)楊樹葉銹病，均從樹冠下部葉片先表現(xiàn)癥狀，越接近樹冠下層，染病越重；距地面越高，染病越輕，自下而上呈逐漸減輕的趨勢。德國林業(yè)專家迪特·澤曼博士（Mr.Dieter Seemann）在對蚌埠市楊樹葉銹病發(fā)生情況實地考察和研究后，也得出相似觀點。出現(xiàn)這種狀況原因可能有兩種：一是楊樹葉銹病的病原菌主要宿存于林下的枯落病葉，夏季雨水迸濺等多種因素助力夏孢子的傳播，傳播順序由下往上；二是成林大樹下部的葉片主要由冬芽發(fā)育而成，發(fā)葉早，冬芽可能帶有越冬的病菌菌絲，導(dǎo)致下部葉片受病菌侵染的時間早且長。綜合這兩個因素，處在樹冠下層的樹葉發(fā)病早而重。

2.2.5 病害與林地管理水平的關(guān)系

根據(jù)調(diào)查，采取修枝除草、深冬清理地表枯枝落葉層等管理措施的林分，林相整齊、林內(nèi)少有雜草枯葉，楊樹生長好，發(fā)病輕或未發(fā)現(xiàn)癥狀；管理粗放的林分，林內(nèi)雜草枯葉多，楊樹生長不良，發(fā)病較重。

此外，連續(xù)3年的林間調(diào)查記錄顯示，各監(jiān)測點楊樹在春季均未發(fā)現(xiàn)銹病癥狀，8月下旬為銹病始現(xiàn)期，9月至10月為發(fā)病盛期，發(fā)病林木在次年春季展葉推遲?！皸顦淙~銹病在本地區(qū)一年只有秋季一次高發(fā)期”這一結(jié)論與多地研究認(rèn)為楊樹葉銹病一年有春、秋兩次高發(fā)期觀點區(qū)別明顯[5-6]。

3 結(jié)論

3.1 病原鑒定

綜合病原菌的形態(tài)特征和ITS rDNA序列，研究鑒定本地區(qū)楊樹葉銹病病原菌為落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）。

3.2 發(fā)病規(guī)律

楊樹葉銹病在本地區(qū)一年只有秋季一次高發(fā)期；該病發(fā)生與轉(zhuǎn)主寄主落葉松關(guān)聯(lián)不密切，在沒有落葉松分布的區(qū)域，該菌也可以夏孢子越冬或以冬芽內(nèi)的菌絲越冬引起翌年侵染；不同品種其發(fā)病程度不同，本地主栽的兩個楊樹品種I-69楊和中林46，其中中林46楊以前易感染銹病，近年來因黑斑病導(dǎo)致其早期落葉，因而遭受感染的機會較少；而對黑斑病高抗的I-69楊，卻成為易感染銹病的品種。楊樹葉銹病發(fā)病程度與夏季降水時長呈現(xiàn)正相關(guān)，夏季陰雨時間越長，病害越重。病害與林地管理水平有一定的關(guān)系，采取修枝、翻耕、施肥等管理措施的林分，楊樹生長好，葉銹病發(fā)病輕；管理粗放的林分，林內(nèi)雜草枯葉多，楊樹生長不良，發(fā)病較重。

[1]鄭世鍇，高瑞桐.楊樹豐產(chǎn)栽培與病蟲害防治[M].北京：金盾出版社，1996.109-113.

[2]馬占鴻，杜榮，汪萬文．新疆楊銹病的發(fā)生與防治試驗簡報[J]．寧夏農(nóng)林科技，1991（2）：24-25．

[3]孟繁榮，薛煜，黃永青．青楊樹葉銹病的研究[J]．林業(yè)科技，1992，17（2）：33-35．

[4]馬忠友，程飛，邱亮，等．一株產(chǎn)植酸酶酵母菌株的分類鑒定與誘變育種[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，04：21-25．

[5]丁維澤，沈樹祥，陳義高．楊樹葉銹病的發(fā)生與防治[J]．農(nóng)家致富，2004（6）：36．

[6]李瀚，曾漢青．青楊樹葉銹病的流行規(guī)律及防治技術(shù)[J]．陜西林業(yè)科技，1999（3）：5l-53．

（責(zé)任編輯：楊婷婷）

Study on the Pathogen Identification and Occurrence Regularities of the Poplar Leaf Rust in Northern Anhui Province

SONG Min1，HONG Shaomin2，CHANG Guangrong1，ZHANG Ming2，LI Ke1，SUN Chong1，REN Dezhu1
（1.Forest Pest and Disease Control and Quarantine Station of Bengbu City，Bengbu 233000，Anhui，China；2.Forestry Bureau of Huaiyuan County）

In this paper a preliminary study was made on the characteristics of the poplar leaf rust and its pathogen morphology in northern Anhui Province.The relationship between the rust occurrence and factors including the poplar varieties，forestland management，precipitation and humidity was analyzed.The pathogen was identified as Melampsora laricipopulina，with modern molecular biology classification technologies.The study showed that the poplar leaf rust has only one high-incidence period in autumn in northern Anhui，its occurrence is closely related with many factors and the disease can harm poplar leaves in consecutive years in case of no alternate hosts.

Poplar leaf rust；Melampsora larici-populina；Pathogen identification；Northern Anhui Province

S763.1

A

2095-0152（2014）06-0010-04

2014-10-27

2014-11-05

蚌埠市科技項目（編號蚌科-2011-33）。

宋敏（1968-），女，高級工程師，主要從事森林病蟲害防治及林業(yè)技術(shù)推廣工作。E-mail：bbslyjck@163.com