豬圓環(huán)病毒2 型Cap蛋白表達(dá)及免疫原性鑒定

朱 鵬，張小飛，徐延偉，尹秀鳳

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司 生物技術(shù)研究所，南京 211102）

豬圓環(huán)病毒2 型Cap蛋白表達(dá)及免疫原性鑒定

朱 鵬1,2，張小飛2，徐延偉2，尹秀鳳2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司 生物技術(shù)研究所，南京 211102）

以豬圓環(huán)病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) WH 株基因組 DNA 為模板，擴(kuò)增 ORF2 截短基因，經(jīng)BamH I /Not I 雙酶切處理后與經(jīng)相同酶切處理的 pET32a (+) 原核表達(dá)載體連接，獲得重組質(zhì)粒 pET32a-Cap2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE 和 Western blot分析。純化的重組蛋白免疫小鼠，并對(duì)獲得的血清進(jìn)行間接 ELISA檢測(cè)和中和活性測(cè)定。SDS-PAGE分析表明，ORF2 截短基因在大腸桿菌中得到表達(dá)，蛋白分子質(zhì)量大小為40 kDa，重組 PCV2 Cap 蛋白主要以上清的形式存在。Western blot證實(shí)重組蛋白能夠識(shí)別抗 PCV2 陽(yáng)性血清。經(jīng)間接ELISA 檢測(cè)，鼠抗PCV2 Cap 血清抗體效價(jià)能達(dá)到1:25 600，間接免疫熒光檢測(cè)分析表明，鼠抗PCV2 Cap血清能特異性識(shí)別PCV2感染細(xì)胞中的Cap蛋白。病毒血清中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗PCV2 Cap血清抗體具有中和病毒的活性，中和效價(jià)為1:36。豬圓環(huán)病毒2型 Cap 蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能及Cap 蛋白亞單位疫苗和檢測(cè)試劑盒的制備奠定了基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型 ；Cap 蛋白；免疫原性；中和活性

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，由 Tischer 于1974年首先在 PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并于1982年命名為豬圓環(huán)病毒。PCV 有2種血清型，即 PCV1和 PCV2[1]。PCV1無(wú)或?qū)ωi的致病性低，廣泛存在豬體內(nèi)和豬腎傳代細(xì)胞系中；PCV2 有致病性，是引發(fā)豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[2]，主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成機(jī)體的免疫抑制[3]。PCV2 與其他細(xì)菌病和病毒病混合感染后，大大加劇豬的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一[4,5]。目前，尚無(wú)控制和消滅 PCV2 感染的有效措施，也無(wú)切實(shí)可行的商品疫苗和藥物來(lái)防止 PMWS 的發(fā)生。我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)受到PCV2 感染的危害日益嚴(yán)峻，研制 PCV2 血清抗體檢測(cè)試劑盒不僅是臨床診斷的迫切需求，同時(shí)也能為疫苗的研制提供必要的技術(shù)手段。

PCV2 含有2個(gè)主要的開放閱讀框( open reading frame,ORF)，其中 ORF2 基因編碼病毒的衣殼蛋白(Cap)是主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，且 PCV1 和 PCV2 之間不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，是檢測(cè)病毒抗體水平的良好抗原[6]，也是發(fā)展新型疫苗的良好靶基因[7]。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在體外表達(dá)的重組 Cap 蛋白（30 kDa）能夠自我組裝為病毒核衣殼樣粒子，并表現(xiàn)出了良好的免疫原性[8]，但因蛋白的表達(dá)量較低，限制了進(jìn)一步的應(yīng)用。趙玲等[9]構(gòu)建了pET32a-ORF2 原核表達(dá)質(zhì)粒，但表達(dá)的蛋白主要以包涵體的形式存在。本研究對(duì) PCV2 ORF2 截短基因進(jìn)行了原核表達(dá)，通過(guò)對(duì)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了可溶性的重組蛋白，并且對(duì)蛋白的免疫原性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究 Cap 蛋白的功能，研發(fā)更為安全、高效、廉價(jià)的 PCV2 Cap 蛋白亞單位疫苗和特異、方便、快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑PCV2 WH 株、PCV2 陽(yáng)性血清、pET-32a(+) 載體系統(tǒng)、受體菌DH5a及BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均由南京天邦生物科技有限公司生物技術(shù)研究所制備并保存；BamH I、NotI、T4 DNA 連接酶、DNA 提取試劑盒、DNA Marker（DL2000）均購(gòu)自 TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒均購(gòu)自 Axygen 生物技術(shù)有限公司；蛋白純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；弗氏佐劑及弗氏不完全佐劑、HRP 標(biāo)記的羊抗豬 IgG 二抗購(gòu)自 Sigma 公司；DAB 顯色試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用 Primer premier5.0 軟件，參考 GenBank 中收錄的多株 PCV2 ORF2 基因序列，去掉 Cap 蛋白N端信號(hào)肽（41個(gè)氨基酸 ），設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為579 bp，并分別在引物上下游引入BamH I 、NotI 酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，上游引物：5'-CTGGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCGC-3'，下游引物5'-AGAGCGGCCGCTTAGGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3'，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.3 ORF2 基因的擴(kuò)增取-70℃ 保存的 PCV2 WH株，接種于已長(zhǎng)滿單層的 PK-15 細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h，收獲全部培養(yǎng)物，用DNA提取試劑盒提取總DNA。建立25 μL 擴(kuò)增體系: rTaq0.3 μL、上下游引物各 1 μL、dNTP 1 μL、模板 DNA 2 μL、10×buffer（Mg2+）2.5 μL 、ddH2O 17.2 μL。按如下程序擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，剩余PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Cap2的構(gòu)建及鑒定分別用BamH I、NotI 雙酶切上述膠回收產(chǎn)物和載體pET32a (+) ，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，分別做PCR及酶切鑒定，選取陽(yáng)性質(zhì)粒，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)一步測(cè)序確證，將陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET32a-Cap2。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS-PAGE 凝膠電泳分析分別將空載體 pET32a(+) 和重組陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂板37℃過(guò)夜。挑取單菌落接種于 LB 液體培養(yǎng)基中（氨芐霉素終濃度100 μg/mL），37℃過(guò)夜后，按1:100 的比例接種于氨芐抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 振蕩培養(yǎng)2～4 h，至OD600值為0.4～0.6 時(shí)加入終濃度為1mmol/L的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導(dǎo) 1、2、3、4、5、6 h時(shí)收集1 mL菌液，4℃、13 000×gr/min 離心1 min，收集菌體，重懸于適量5×SDS 上樣緩沖液中，沸水浴10 min，取10 μL 13 000×g進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.6 重組蛋白的可溶性分析將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，4℃、13 000×g離心 10 min，收集菌體，加入適量的 PBS 重懸，在冰浴上進(jìn)行超聲波破碎，2 s/次，間隔2 s，超聲10 min，4℃、13 000×g離心 10 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳分析。

1.7 重組蛋白的純化按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司蛋白純化試劑盒純化重組蛋白，超聲破碎后的上清按說(shuō)明書進(jìn)行純化。收集目的蛋白洗脫液，用SDA-PAGE檢測(cè)蛋白純度，目的蛋白濃縮后用蛋白定量試劑盒定量。

1.8 融合蛋白的 Western blot 鑒定將純化后的樣品經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂乳37℃封閉2 h，PBST洗滌5次；用1:100 稀釋的抗PCV2陽(yáng)性血清作為一抗37℃孵育1 h，PBST洗滌5次；放入1:8000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗豬的二抗中，37℃作用40 min，PBST 洗滌5次后，DAB進(jìn)行顯色。

1.9 重組Cap蛋白免疫原性的鑒定將純化后目的蛋白與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后，對(duì)5只6～8 w BALB/c雌性小鼠，以50 μg /只的劑量進(jìn)行頸部、背部多點(diǎn)皮下注射。初次免疫后14 d，將目的蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，同時(shí)用健康的小鼠做對(duì)照。免疫后每周采血分離血清，檢測(cè)其抗體效價(jià)。

1.10 免疫血清中和活性的測(cè)定選取抗體效價(jià)較高的血清，采用固定病毒稀釋抗體的方法進(jìn)行病毒中和實(shí)驗(yàn)，以能夠抑制50%細(xì)胞出現(xiàn)熒光的血清最高稀釋度作為中和抗體滴度，用來(lái)檢測(cè)小鼠抗PCV2 Cap 血清抗體的中和病毒活性。同時(shí)設(shè)抗PCV2陽(yáng)性血清和健康小鼠血清做對(duì)照。將小鼠血清置56℃水浴滅活30 min，取滅活的血清用含2%小牛血清的DMEM細(xì)胞維持液做1:2系列稀釋，加入等體積的病毒液（100TCID50/mL）混合，37℃感作2 h，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組和健康細(xì)胞對(duì)照組。取混合液200 μL分別加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上已長(zhǎng)成單層的PK-15細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度接種5孔細(xì)胞。將細(xì)胞板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，采用間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofluorescence assay,IFA）法檢測(cè)各孔抗原，根據(jù)Reed-Muench法，計(jì)算血清中和效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 ORF2 基因的擴(kuò)增取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得與預(yù)期大小相符的 579 bp條帶（見(jiàn)圖1）。

圖1 豬圓環(huán)病毒ORF2基因的 PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplifi cation of PCV2 ORF2 gene

2.2 表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Cap2 的構(gòu)建和鑒定分別用特異性引物和通用引物對(duì)pET32a-Cap2重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，經(jīng)特異性引物鑒定，其大小為579 bp；經(jīng)通用引物鑒定，其大小為1300 bp 左右（圖2）；雙酶切結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-Cap2構(gòu)建正確（圖3）。測(cè)序結(jié)果顯示，插入的目的片段正確，沒(méi)有出現(xiàn)堿基突變。

2.3 重組Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化經(jīng)SDS-PAGE析表明，重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可獲得分子質(zhì)量大約為40 kDa 的蛋白，而空pET32a (＋) 轉(zhuǎn)化的菌體在40 kDa附近沒(méi)有出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的增加，蛋白表達(dá)量增多，6 h后目的蛋白不再增加（圖4）。將收集的菌液進(jìn)行超聲波破碎，離心后取其上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在37℃誘導(dǎo)條件下，沉淀中目的蛋白的量較大，而上清中目的蛋白較少。進(jìn)一步調(diào)整誘導(dǎo)條件，發(fā)現(xiàn)在蛋白誘導(dǎo)過(guò)程中，降低溫度可以使表達(dá)產(chǎn)物大部分以上清的形式存在。在低于30℃的條件下誘導(dǎo)7 h，表達(dá)產(chǎn)物主要以上清的形式存在，而沉淀中的目的蛋白卻很少。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延續(xù)，表達(dá)產(chǎn)物開始以上清和包涵體兩種形式存在，表明通過(guò)改變誘導(dǎo)條件，重組蛋白可以以上清的形式表達(dá)。用Ni-NTA瓊脂糖對(duì)超聲后的上清進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析可獲得單一純化蛋白（圖5）。利用蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)，純化蛋白的純度在90%以上，其濃度為0.2 mg/mL。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-Cap2的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET32a-Cap2

圖3 重組質(zhì)粒 pET32a-Cap2 雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET32a-Cap2 by double digestion

圖4 重組Cap蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of recombinant Cap protein by SDS-PAGE

圖5 重組Cap 蛋白的可溶性分析Fig.5 Solubility analysis of the recombinant Cap protein by SDS-PAGE

2.4 融合蛋白的 Western blot 結(jié)果Western blot 鑒定結(jié)果顯示，在目標(biāo)條帶位置上出現(xiàn)一條明顯的棕色印記，而空載體轉(zhuǎn)化菌在相應(yīng)位置則無(wú)顏色反應(yīng)條帶，表明該蛋白得到了正確表達(dá)并具有良好的反應(yīng)原性（圖6）。

圖6 重組Cap蛋白的 Western blot分析結(jié)果Fig.6 Analysis of the recombinant Cap protein by Western blot

2.5 重組Cap蛋白免疫原性的鑒定采集經(jīng)重組Cap蛋白免疫的小鼠血清，用間接 ELISA 測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示鼠抗重組Cap蛋白的血清抗體效價(jià)最高可達(dá)1:25 600。結(jié)果表明，重組Cap蛋白具有良好的免疫原性。

2.6 病毒感染細(xì)胞中PCV2 Cap的檢測(cè)以鼠抗PCV2 Cap蛋白免疫血清為一抗，采用IFA法對(duì)PCV2感染細(xì)胞中的Cap蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，抗體能與PCV2感染的PK-15細(xì)胞發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)照組則無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)（圖7），表明制備的抗體能夠特異性的識(shí)別自然的PCV2 Cap蛋白。

2.7 免疫血清中和活性的測(cè)定血清中和實(shí)驗(yàn)表明，鼠抗PCV2 Cap蛋白的血清中和效價(jià)為1:36，具有一定的中和活性（表8）。

3 討論

自1991年加拿大首次報(bào)道由PCV2引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）以來(lái)，PMWS相繼在全世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外諸多機(jī)構(gòu)都在積極的開展PCV2防治的研究，越來(lái)越多的商品化的疫苗正在出現(xiàn)。目前，市場(chǎng)上商品化的PCV2疫苗主要有：基因工程亞單位疫苗和滅活疫苗[10]。我國(guó)于2010年研制出了PCV2滅活疫苗。由于PCV2在PK15細(xì)胞上的增殖滴度不高，病毒培養(yǎng)成本高、周期長(zhǎng)且病毒培養(yǎng)物不易純化，給研究和生產(chǎn)帶來(lái)了一定的困難，因此利用基因工程方法獲得安全、高效、廉價(jià)的新型亞單位疫苗是我國(guó) PCV2疫苗研究的方向[11]。

圖7 PCV2病毒感染細(xì)胞中 Cap的間接免疫熒光檢測(cè)Fig.7 IFA analysis of PCV2 Cap in PK-15 cell inoculated with PCV2

表8 鼠抗血清中和活性的測(cè)定Table 8 The determination of serum neutralizaing activity

由于ORF2基因的前123 bp中富含稀有密碼子，這段序列是與核定位有關(guān)的信號(hào)肽序列，在原核表達(dá)中難度很大且表達(dá)效果很差，原因可能在于其N端特殊的氨基酸組成：序列高度保守，N端核內(nèi)化信號(hào)肽含有大量的精氨酸，具有很強(qiáng)的疏水性，并且主要由稀有密碼子編碼。ORF2的核內(nèi)化信號(hào)肽中高含量的精氨酸，會(huì)消耗大腸桿菌中大量編碼精氨酸的tRNA，而此tRNA在大腸桿菌中本身含量就不多，即tRNA的量限制了蛋白合成速度，這些稀有密碼子的連續(xù)出現(xiàn)甚至?xí)种频鞍踪|(zhì)的合成，導(dǎo)致蛋白合成的早期終止[12]。Liu等[6]用大腸桿菌表達(dá)了PCV2 Cap 蛋白全基因，但表達(dá)量較低，甚至檢測(cè)不到目的蛋白。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單，表達(dá)外源基因的周期較短等。本試驗(yàn)中對(duì)ORF2的前123 bp進(jìn)行人為剪切后，剩余的579 bp獲得了表達(dá)，且表達(dá)的蛋白保留了PCV2 Cap蛋白原有的4個(gè)免疫反應(yīng)區(qū)域。通過(guò)對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)降低IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度及搖床轉(zhuǎn)速，重組蛋白會(huì)以上清的形式表達(dá)，避免了包涵體形式的蛋白繁瑣的復(fù)性過(guò)程，純化時(shí)非常方便且抗原性更好。經(jīng)Western blot檢測(cè)表明，表達(dá)的Cap融合蛋白能被豬PCV2陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的免疫原性。利用純化后的蛋白免疫小白鼠，獲得了抗Cap蛋白的鼠抗血清。IFA表明該血清具有良好的特異性，中和試驗(yàn)表明，鼠抗PCV2 Cap蛋白抗體具有一定的中和活性。PCV2型 Cap蛋白的表達(dá)，為病毒的檢測(cè)以及PCV2亞單位疫苗的制備打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步深入研究 Cap 蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] Sanchez R E Jr,Nauwynck H J,McNeilly,et al. Porcine circovirus 2 infection in swine foetuses inoculated at different stages of gestation[J]. Vet Microbiol,2003,83(2): 169-176.

[2] Allan G M,McNeilly F,Meehan B M,et al. Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain,Denmark and Northern Ireland[J]. Vet Microbiol,1991,66(2): 115-123.

[3] Chianini F,Majo N,Segale's J,et al. Immunohistochemical characterisation of PCV2 associate lesions in lymphoid and non-lymphoid tissues of pigs with natural postweaning multisystemic wasting syndrome PMWS[J]. Vet Immunol Immunopathol,2003,94(1-2): 63-75.

[4] Allan G M,Ellis J A. Porcine circoviruses: a review [J].J Vet Diag Invest ,2000,12(1): 3-14.

[5] 朗洪武,張廣川,吳發(fā)權(quán),等. 斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征血清抗體檢測(cè)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技,2000,30(3): 3-5.

[6] Liu Q,Tikoo S K,Babiuk L A. Nuclear location of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2 [J]. Virology,2001,285(1): 91-99.

[7] Shang S B,Jin y L,Jiang X T,et al. Fine mapping of antigenic epitope on capsid proteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2 [J]. Vet Immunol Immunopathol,2009,46(3): 327-334.

[8] Nawangitgul P,Morozov I,Bolin S R,et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a majorcapsid protein[J]. J Gen Virol,2000,81(Pt9): 2281-2287.

[9] 趙玲,朱玲,郭萬(wàn)柱,等. 豬圓環(huán)病毒2型Cap 蛋白的表達(dá)及在 ELISA中的初步應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42 (6): 808-814.

[10] Grau-Roma L,Fraile L,Segales J. Recent advances in the epidemiology,diagnosis and control of disease caused by porcine circovirus type 2[J]. Vet J,2010,187(1): 23-32.

[11] 范紅結(jié),王霞,陳孝明,等. 豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的分泌表達(dá)及其免疫原性研究[J]. 畜牧與獸醫(yī),2012,44(11): 27-32.

[12] Lekcharoensuk P,Morozov I,Paul P S,et al. Epitope mapping of the major capsid protein of type 2 Porcine circovirus (PCV2) by using chemeric PCV1 and PCV2 [J]. Virology,2004,78(15): 8135-8145.

EXPRESSION AND IMMUNOGENICITY OF RECOMBINANT CAP PROTEIN OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2

ZHU Peng1,2,ZHANG Xiao-fei2,XU Yan-wei2,YIN Xiu-feng2
(1. College of Veterinary Medicine,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China; 2. Biotechnology Research Institute,Nanjing Techbank Bio-industry Co. Ltd.,Nanjing 211102,China)

The truncated ORF2 of Porcine circovirus type 2(PCV2) WH strain was amplifi ed and cloned into expression vector pET32a (+). The expression vector pET32a-Cap2 was then transformed into BL2 (DE3) for expression with induction of IPTG. The expressed pET32a-Cap products were analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The recombinant Cap protein was a soluble protein with molecular weight of 40 kDa. The purifi ed Cap protein was used to immunize mice to prepare antiserum. The resulting murine antiserum had ELISA titer at over 1:25 600 and reacted with PCV2 in infected PK-15 cells in indirect immunofl uorescence assay (IFA). The murine antiserum also showed neutralizing titer at 1:36. The availability of the recombinant PCV2 Cap protein provides the basis for development of vaccine and diagnostic reagents.

Porcine circovirus type 2; Cap protein; immunogenicity; neutralization

S852.659.2

A

1674-6422（2014）05-0028-07

2014-03-07

朱鵬，男，碩士，主要從事動(dòng)物疾病研究

張小飛，E-mail：xiaofei0804@sina.com