六株鴿源新城疫病毒的分離、鑒定及生物信息學(xué)分析

李仕超，仇旭升，劉開春，周錦萍，劉 健，鞠厚斌，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，劉佩紅，丁 鏟

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241；2. 上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103）

·研究論文·

六株鴿源新城疫病毒的分離、鑒定及生物信息學(xué)分析

李仕超1，仇旭升1，劉開春1，周錦萍2，劉 健2，鞠厚斌2，譚 磊1，孫英杰1，宋翠萍1，劉佩紅2，丁 鏟1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241；2. 上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103）

新城疫是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種禽類傳染病。近年來，鴿新城疫的流行越來越嚴(yán)重，引起了養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者的廣泛關(guān)注。本研究在4批發(fā)病鴿組織病料中分離到了4株鴿源新城疫強(qiáng)毒株和2株鴿源弱毒株。病毒分離株經(jīng)雞胚有限稀釋法純化5次后，新鮮尿囊液用于提取病毒RNA。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、測序得到分離株的F基因和HN基因序列。通過對(duì)F基因的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，4株鴿源強(qiáng)毒株屬于ClassⅡ基因Ⅵb亞型，2株鴿源弱毒株與Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。進(jìn)一步遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，4株鴿源新城疫病毒強(qiáng)毒株與目前國內(nèi)流行株屬于同一遺傳分支，這些毒株與歐洲流行株親緣關(guān)系十分相近，而與中國20世紀(jì)90年代鴿源分離株遺傳距離稍遠(yuǎn)，因此推測當(dāng)前鴿源流行強(qiáng)毒株可能源自歐洲。生物信息學(xué)分析顯示鴿源毒株HN蛋白345～353位的一個(gè)線性抗原表位發(fā)生了改變，而血清學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示La Sota疫苗株和鴿源毒株的交叉血凝抑制存在明顯差異，暗示鴿源毒株已經(jīng)發(fā)生了抗原性變異。因此，使用雞疫苗株La Sota免疫鴿存在免疫失敗的風(fēng)險(xiǎn)，需要研發(fā)鴿專用新城疫病毒疫苗用于鴿新城疫的防疫工作。

新城疫病毒；鴿源；基因型Ⅵb亞型；F基因；HN基因

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、烈性、高度接觸傳染性禽類傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必報(bào)傳染病[1]。NDV主要感染禽類，感染率和死亡率可達(dá)100%[2]。NDV根據(jù)致病力差異，可分為弱毒株（lentogenic）、中等毒力株（mesogenic）和親內(nèi)臟型強(qiáng)毒株或嗜神經(jīng)毒株（viscerotropic or neurotropic velogenic）三種類型。NDV只有一個(gè)血清型，根據(jù)基因遺傳距離和基因組長度可以將NDV基因型分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個(gè)大類，前者包括基因1～9型，后者包括基因Ⅰ～Ⅺ型。NDV屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avuluvirus），是一種單股、負(fù)鏈、線性、不分節(jié)段的RNA病毒，編碼NP、P、M、F、HN和L六種結(jié)構(gòu)蛋白和V、W兩種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中F蛋白和HN蛋白與NDV毒力密切相關(guān)。F蛋白是NDV感染細(xì)胞所必需的一種囊膜糖蛋白，能促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞和相鄰宿主細(xì)胞之間的融合，調(diào)節(jié)病毒的入侵和病毒粒子的釋放[3]。HN蛋白也是位于NDV表面的一種囊膜糖蛋白，主要參與宿主細(xì)胞的吸附。F和HN蛋白是與NDV抗原性最為相關(guān)的兩種病毒蛋白。

鴿新城疫，即鴿瘟，最早被稱為鴿副黏病毒病，該病病原與雞NDV在血清學(xué)上沒有顯著差異，兩者基因序列同源性較高。引起鴿新城疫的NDV毒株一般屬于ClassⅡ基因VI型或VII型?；騐II型NDV是目前雞群中主要的流行毒株，而基因VI型NDV對(duì)雞亦有很強(qiáng)的致病力。鴿感染新城疫的流行歷史可以追溯至20世紀(jì)70年代，1977年在伊拉克被發(fā)現(xiàn)后開始迅速傳播[4]，1981年傳播到埃及，并開始在意大利賽鴿和笑鴿（亦稱塞內(nèi)加爾鴿）中爆發(fā)[5]。鴿ND迅速在世界范圍內(nèi)傳播，并傳播給其他家禽，包括歐洲大部分地區(qū)，以色列、埃及、蘇丹、印度、烏干達(dá)、南非、香港、日本、加拿大和北美養(yǎng)禽業(yè)遭受了巨大的損失。1984年英國的家禽中開始流行鴿NDV的變異株[6]。這也就是世界公認(rèn)的第三次ND大流行[7]。

本研究分離鑒定了的6株鴿源NDV毒株，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其F基因和HN基因序列。通過遺傳進(jìn)化分析，確定了分離株的基因型及其與當(dāng)前鴿源流行株、疫苗株的親緣關(guān)系。同時(shí)，本研究通過生物信息學(xué)軟件分析了病毒蛋白抗原性、疏水性，結(jié)合血清學(xué)研究，比較了鴿源分離株與常用疫苗株的抗原差異性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；雞抗La Sota高免血清、鴿抗La Sota血清及鴿抗ND167血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；1%雞紅細(xì)胞、含青霉素和鏈霉素兩種抗生素的PBS（簡稱雙抗PBS）按照OIE標(biāo)準(zhǔn)制備；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（RNasin）和pGEM-T easy Vector購自Promega公司；PCR mix購自東盛生物公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及DH5α感受態(tài)細(xì)菌等購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 病毒分離自山東省聊城市55周齡的發(fā)病蛋鴿采集臟器病料1份，上海養(yǎng)鴿場發(fā)病乳鴿病料3份。分離株雞胚有限稀釋法純化5次，按照OIE常規(guī)方法進(jìn)行HA效價(jià)檢測和HI血清學(xué)鑒定。

1.3 交叉血凝抑制試驗(yàn)按照OIE常規(guī)方法分別配制La Sota、ZJ1、9a5b及鴿源分離毒株的4單位病毒。用雞抗La Sota血清、鴿抗La Sota血清、鴿抗ND167血清3種血清對(duì)4單位病毒進(jìn)行交叉血凝抑制效價(jià)的測定。其中鴿的兩種血清分別用1%雞紅細(xì)胞處理（鴿血清與1%雞紅細(xì)胞混合，37℃作用10 min后離心取上清），處理前后分別測定對(duì)病毒的血凝抑制效價(jià)。

1.4 引物設(shè)計(jì)參照GenBank中基因Ⅵ型新城疫病毒IT-227/82毒株（GenBank登錄號(hào)：AJ880277）設(shè)計(jì)3對(duì)引物：VI F4205和VI R5039、VI F5126和VI R7041、VI F6818和VI R8791，由上海生物工程有限公司合成。針對(duì)禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）HA、NP和NA基因的3對(duì)引物HA-F和HA-R、NP-F和NP-R、NA-F和NA-R由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽流感實(shí)驗(yàn)室提供。引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增片段用引物序列Table 1 Primers sequence used in the amplifi cation

1.5 病毒基因擴(kuò)增分離株通過雞胚有限稀釋法純化5次后用于后續(xù)研究。

1.5.1 病毒RNA提取 取250 μL新鮮尿囊液，加入500 μL Trizol，混勻后室溫靜置10 min。加入200 μL氯仿、20 μg糖原，振蕩混勻，14 000×g、4℃離心10 min。取400 μL上清，加入400 μL異丙醇，-20℃靜置10 min后，14 000×g、4℃離心10 min。70%酒精漂洗2次，沉淀干燥后加入40 μL RNAse-free水溶解備用。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄 取32.5 μL病毒RNA，依次加入RNA酶抑制劑1 μL、5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10 μL、2.5 mmol/L dNTP mix 4 μL、6 nt隨機(jī)引物1 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，37℃水浴2.5 h，70℃水浴作用滅活5 min。

1.5.3 PCR反應(yīng) 將尿囊液提取的cDNA分別用NDV、AIV引物擴(kuò)增。針對(duì)NDV F基因片段的鑒定引物為VIF4205和VIR5039；針對(duì)AIV HA、NP和NA基因的鑒定引物為HA-F和HA-R、NP-F和NP-R，NA-F和NA-R；擴(kuò)增ClassⅡ基因VI型NDV-F和HN全基因的引物為VIF5126和VIR7041、VIF6818和VIR8791（引物序列在表1中列出)。PCR反應(yīng)體系按照東盛公司PCR mix說明書進(jìn)行。

1.5.4 基因克隆和測序 PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢查結(jié)果。利用天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒提取PCR產(chǎn)物，將其連入pGEM-T easy Vector。按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒。酶切鑒定后，陽性質(zhì)粒送上海生工公司測序。

1.6 遺傳進(jìn)化分析利用生物信息學(xué)軟件Lasergene軟件的MegAlign模塊和MEGA軟件比對(duì)分離株與GenBank中公布的NDV經(jīng)典毒株基因序列同源性，并繪制遺傳進(jìn)化發(fā)生樹。NDV主要參考毒株名稱和登錄號(hào)在表2中列出。

表2 系統(tǒng)發(fā)育樹中參考的部分新城疫病毒全長序列的GenBank登錄號(hào)Table 2 Accession number of the complete genome of NDV strains referred in the phylogenetic tree

1.7 抗原性分析利用生物信息學(xué)軟件Lasergene軟件的EditSeq模塊根據(jù)測序結(jié)果預(yù)測NDV分離株F和HN蛋白氨基酸序列，并使用Protein模塊對(duì)4株病毒的F蛋白和HN蛋白進(jìn)行抗原性和疏水性分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離情況采集鴿病料4份，按質(zhì)量體積比1:5的比例加入無菌雙抗PBS，研磨后離心，上清接種雞胚。接種胚自48 h開始出現(xiàn)死亡，至84 h雞胚無存活。通過雞胚有限稀釋法純化5代，從中分離到6株病毒，分別命名為Pi/China/SD/2012/132株（標(biāo)記為ND132）、Pi/China/SH/2013/163株（標(biāo)記為ND163）、Pi/China/SH/2013/164株（標(biāo)記為ND164）、Pi/China/SH/2013/167株（標(biāo)記為ND167）、Pi/China/SH/2013/168株（標(biāo)記為ND168）和Pi/China/SH/2013/169株（標(biāo)記為ND169）。5代純化后，6株病毒尿囊液的血凝價(jià)分別測定為25、26、29、26、26和29。

2.2 交叉血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果利用La Sota和鴿源分離株的病原和血清進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)，測定交叉血凝抑制效價(jià)如表3，表中數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)測定的平均值。血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示鴿La Sota血清能夠有效中和鴿源毒株的血凝反應(yīng)，而鴿抗ND167血清不能夠有效中和La Sota株的血凝反應(yīng)。

表3 兩種血清對(duì)不同病毒的血凝抑制效價(jià)Table 3 Cross-hemagglutination inhibition titers of two serums for different strains

為了明確鴿源毒株與La Sota株之間的抗原性差異，根據(jù)公式R=計(jì)算病毒的抗原相似系數(shù)R值，其中r1=甲血清對(duì)乙抗原的血抑滴度／甲血清對(duì)甲抗原的血抑滴度；r2=乙血清對(duì)甲抗原的血抑滴度／乙血清對(duì)乙抗原的血抑滴度。R代表兩病毒株間的抗原性差異，R＜0.5表示抗原差異性大；0.5≤R＜0.67表示病原抗原差異小；0.67≤R≤1.5表示無抗原性差異。計(jì)算得出鴿源分離株ND167與La Sota的病原相似系數(shù)R值為0.3，表明本研究分離到的鴿源毒株與La Sota株間存在明顯的抗原性差異。

2.3 病毒基因擴(kuò)增結(jié)果用NDV通用鑒定引物VIF4205/VIR5039擴(kuò)增ND132、ND163、ND167和ND168四株病毒的F基因片段，擴(kuò)增出800 bp左右目的條帶（見圖1）；而用AIV的3組鑒定引物均不能擴(kuò)增出相應(yīng)目的片段。利用NDV F和HN基因擴(kuò)增引物VIF4967/VIR7041和VIF6818/VIR8791也可擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段（圖略）。分別回收PCR片段，將其連入pGEM-T easy Vector后質(zhì)粒送生工測序。測序結(jié)果用Lasergene軟件MegAlign模塊進(jìn)行拼接，獲得完整的分離株F和HN基因序列。

圖1 引物VIF4205/VIR5039擴(kuò)增ND132、ND163、ND167、ND168結(jié)果Fig.1 The electrophoresis result of ND132,ND163,ND167,ND168 amplifi ed by VIF4205 /VIR5039

2.4 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果利用MEGA軟件對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示本研究中分離到的ND132、ND163、ND167、ND168均屬于ClassⅡ類基因Ⅵb亞型，與國內(nèi)目前流行毒株同源性較高（圖2）。在ND163和ND168病料中，同時(shí)分離到2株弱毒NDV株，分別命名為ND164和ND169。測序結(jié)果顯示這2株病毒與ClassⅡ基因Ⅱ型經(jīng)典疫苗株La Sota F基因片段的同源性高達(dá)99.9%，推測為兩家疫苗廠使用的La Sota活疫苗污染。

圖2 根據(jù)ND132、ND163、ND167、ND168 F基因前163個(gè)氨基酸位點(diǎn)測序結(jié)果，采用MEGA軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of NDV strain ND132,ND163,ND167 and ND168 using MEGA based on comparison of first 163 aa of F gene

用Lasergene軟件預(yù)測獲得鴿源NDV分離株F和HN蛋白氨基酸序列，與La Sota株序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，3株上海株病毒蛋白的同源性均高于99.8%，而3株上海株與山東ND132同源性為95.1%～96.5%。4株鴿源VIb亞型分離株F蛋白裂解位點(diǎn)基序均為112 RRQKR F 117，即標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)；HN長度均為1716 nt，編碼571 aa，均符合強(qiáng)毒株的基因特征。

2.5 抗原性分析結(jié)果利用生物信息軟件對(duì)4株分離株F蛋白和HN蛋白的抗原性和疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)差異外，與經(jīng)典La Sota的F蛋白和HN蛋白的抗原性和疏水性呈現(xiàn)整體一致性（圖3為ND167與La Sota比較）。NDV HN蛋白345～353位的aa普遍存在一個(gè)線性抗原表位，單個(gè)氨基酸的突變會(huì)改變單抗對(duì)病毒的識(shí)別。本研究發(fā)現(xiàn)4株鴿源分離株在該位點(diǎn)存在2個(gè)突變：G347E和E349D，表明該抗原表位已經(jīng)發(fā)生改變。而HN蛋白受體結(jié)合部位和NA活性位點(diǎn)氨基酸序列則沒有發(fā)生突變，均為E401、R416、Y526和R174；6個(gè)保守潛在糖基化位點(diǎn)也沒有發(fā)生變化，均為119、341、433、481、508和538位的aa。

圖3 新城疫病毒ND167和La Sota株F和HN蛋白的抗原性與疏水性比較Fig .3 Comparison of the antigenicity and hydrophobicity of the F and HN protein between La Sota and ND167a: F蛋白抗原性; b: F蛋白疏水性; c: HN蛋白抗原性; d: HN蛋白疏水性a: Antigenicity of F; b: Hydrophobicity of F; c: Antigenicity of HN; d: Hydrophobicity of HN

3 討論

新城疫是一種急性、烈性禽類傳染病，對(duì)我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，鴿中流行的新城疫也越來越受到重視。由于鴿活動(dòng)范圍廣，其攜帶的傳染病原嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。鴿新城疫最早于1963年發(fā)現(xiàn)于德國，自1977年在中東地區(qū)發(fā)現(xiàn)后，迅速傳播到歐洲、美國等地。20世紀(jì)80年代，在東歐的野鴿中報(bào)道了低致病性鴿源副粘病毒的爆發(fā)[5]，隨后這一病毒又傳播到意大利[8]和東歐的野鴿及賽鴿[9]。1984年在英國感染鴿的排泄物引發(fā)22例雞新城疫[10]，至此，鴿新城疫對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的威脅逐漸受到重視。2001年，加拿大有一場類似的鴿副粘病毒的爆發(fā)[11]。2010年法國和2011年瑞典相繼在動(dòng)物健康和獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)（Animal Health and Vetevinary Laboratories Agency,AHVLA）報(bào)導(dǎo)了養(yǎng)禽業(yè)中鴿源新城疫的感染，并懷疑是由于野禽進(jìn)入家禽中引起。澳洲的賽鴿和觀賞鴿在2011年也分離到了首例鴿新城疫。目前為止，鴿新城疫在歐洲國家被認(rèn)為是一種地方性流行病[12]。1985年，該病傳播到亞洲[13-15]。自深圳及珠海檢出鴿NDV后，南方沿海地區(qū)、江浙滬及山東省、北京市、黑龍江省等北方地區(qū)，乃至甘肅省、新疆維吾爾族自治區(qū)等地均有此病出現(xiàn)。近年來，我國鴿養(yǎng)殖量越來越大，養(yǎng)殖種類也越來越多，疫病的防控也因而顯得更加重要。對(duì)鴿源NDV的分子流行病學(xué)研究，可為預(yù)測疾病的流行趨勢和毒力進(jìn)化提供數(shù)據(jù)支持，為疫病防控和研制有效疫苗、制定科學(xué)有效的防疫措施提供理論依據(jù)，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，分離的ND132、ND163、ND167、ND168 4個(gè)NDV毒株均屬于ClassⅡ基因Ⅵb型。分離到的4株鴿源強(qiáng)毒株與目前國內(nèi)分離到的鴿源NDV一樣，均屬于ClassⅡ基因Ⅵb亞型。劉華雷等[16]對(duì)北京市、江蘇省分離到的5株鴿源NDV（包括）進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果也為Ⅵb亞型。2010～2012年在我國分離到的8株鴿Ⅰ型副粘病毒也屬于Class Ⅱ基因Ⅵb亞型，其中pi/CH/LLN/110713（GenBank登錄號(hào)：JX486552）是我國首次報(bào)導(dǎo)的分離自中國且與國外毒株相似的毒株，推測中國的鴿源副粘病毒可能源自海外[15]。Ⅵb亞型NDV對(duì)鴿子具有較強(qiáng)的宿主特異性。本研究分離得到的4株鴿源毒株與dove/Italy/2736/00毒株（GenBank登錄號(hào)：AY562989）在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系十分相近，推測這4株鴿源強(qiáng)毒株可能是由賽鴿比賽等原因由歐洲傳到中國。

分離到的ND163和ND168中混有基因Ⅱ型疫苗株La Sota，推測是由于鴿場長期對(duì)幼鴿使用La Sota活疫苗免疫對(duì)病料造成了污染。鴿場在使用La Sota免疫鴿子后，并沒有起到有效的保護(hù)作用。因此，本研究集中研究了鴿Ⅵ型NDV與經(jīng)典的La Sota毒株的基因和蛋白差異。3株上海株病毒蛋白的同源性均高于99.8%，與山東ND132同源性為95.1%～96.5%。4株病毒F蛋白112～117位蛋白酶裂解位點(diǎn)富含強(qiáng)堿性氨基酸，HN長度均為1716 nt，571 aa，符合強(qiáng)毒株的顯著序列特征。鴿源毒株F蛋白和HN蛋白的抗原性和疏水性與經(jīng)典La Sota弱毒株基本一致，而F和HN是決定病毒抗原性的主要蛋白，表明分離的鴿源NDV與雞NDV抗原性整體差異不大。本研究發(fā)現(xiàn)4株鴿源NDV分離株與La Sota株主要的抗原差異位點(diǎn)在于HN蛋白的一個(gè)線性抗原表位345～353處的aa。4株鴿源分離株在該位點(diǎn)存在2個(gè)突變：G347E和E349D，單個(gè)氨基酸的突變會(huì)改變單抗對(duì)病毒的識(shí)別，表明該抗原表位已經(jīng)發(fā)生了改變。

血清學(xué)試驗(yàn)顯示La Sota疫苗株和鴿源毒株的交叉血凝抑制存在明顯差異。抗La Sota鴿血清能夠有效中和鴿源毒株的血凝反應(yīng)，而抗鴿源毒株的血清卻不能夠有效中和La Sota株的血凝反應(yīng)?？乖嗨葡禂?shù)表明鴿源NDV強(qiáng)毒株與La Sota的抗原性差異顯著，這與生物信息學(xué)分析的結(jié)果并不完全一致，暗示鴿源NDV毒株某些氨基酸位點(diǎn)的突變可能造成了抗原空間結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而對(duì)抗原蛋白的空間表位造成了影響。因此，在實(shí)踐中使用La Sota疫苗對(duì)鴿子進(jìn)行免疫存在著免疫失敗的風(fēng)險(xiǎn)，急需有針對(duì)性地研發(fā)鴿專用NDV疫苗，以促進(jìn)我國養(yǎng)鴿業(yè)健康發(fā)展。

[1] Ballagi-Pordány A,Wehmann E,Herczeg J,et al. Identification and grouping of Newcastle disease virus strains by restriction site analysis of a region from the F gene [J]. Arch Virol,1996,141(2): 243-261.

[2] Miller P J,Decanini E L,Afonso C L,et al. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges [J]. Infect Genet Evol,2010,10(1): 26-35.

[3] de Leeuw O S,Koch G,Hartog L,et al. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein [J]. J Gen Virol,2005,86(6): 1759-1769.

[4] Kaleta E F,Alexander D J,Russell P H,et al. The first isolation of the avian PMV-1 virus responsible for the current panzootic in pigeons ? [J]. Avian Pathol,1985,14(4): 553-557.

[5] Biancifiori F,Fioroni A. An occurrence of Newcastle disease in pigeons: virological and serological studies on the isolates [J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis,1983,6(3): 247-252.

[6] Alexander D J,Wilson G W,Russell P H,et al. Newcastle disease outbreaks in fowl in Great Britain during 1984 [J]. Vet Rec,1985,117(17): 429-434.

[7] Box P G,Holmes H C,McCartney E,et al. Vaccination of pigeons against paramyxovirus 1 infection [J]. Vet Rec,1985,117(21): 555-556.

[8] Terregino C G,Cattoli C G,Gorssele B,et al.Characterization of Newcastle disease virus isolates obtained from Eurasian collared doves (Streptopelia decaocto) in Italy [J]. Avian Pathol,2003,32(1): 63-68.

[9] Ujvári D E,Wehmann E,Kaleta E F,et al. Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livia) and suggests multiple species transmission [J]. Virus Res,2003,96(1-2): 63-73.

[10] Aldous E W,Feller C M,Mynn J K,et al. A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons [J]. Avian Pathol,2004,33(1-2): 258-269.

[11] Toro H F,Hoerr J,Farmer K,et al. Avian paramyxovirus: association with common avian pathogens in chickens and serologic survey in wild birds [J]. Avian Dis,2005,49(1): 92-98.

[12] Alexander D J. Newcastle disease in the European Union 2000 to 2009 [J]. Avian Pathol,2011,40(6): 547-558.

[13] Lister S A,Alexander D J,Hogg R A,et al. Evidence for the presence of avian paramyxovirus type 1 in feral pigeons in England and Wales [J]. Vet Rec,1986,118(17): 476-479.

[14] Alexander D J,Parsos G,Marshall R,et al. Infection of fowls with Newcastle Disease virus by food contaminated with pigeon faces [J]. Vet Rec,1984,115(23): 601-602.

[15] Guo H,Liu X,Han Z,et al. Phylogenetic analysis and comparison of eight strains of pigeon paramyxovirus type 1 (PPMV-1) isolated in China between 2010 and 2012 [J]. Arch Virol,2013,158(6): 1121-1131.

[16] 劉華雷,周斌,郁斌,等. 五株鴿副粘病毒國內(nèi)分離株F基因片段的克隆與分子特性[J]. 病毒學(xué)報(bào),2004,20(4): 378-381.

ISOLATION,IDENTIFICATION AND BIOINFORMATICS ANALYSIS OF SIX NEWCASTLE DISEASE VIRUSES OF PIGEON ORIGIN

LI Shi-chao1,QIU Xu-sheng1,LIU Kai-chun1,ZHOU Jin-ping2,LIU Jian2,JU Hou-bin2,TAN Lei1,SUN Ying-jie1,SONG Cui-ping1,LIU Pei-hong2,DING Chan1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China; 2.Shanghai Animal Disease Control Center,Shanghai 201103,China)

Newcastle disease is a severe infectious disease in birds,threatening poultry industry worldwide. Pigeons are very susceptible to Newcastle disease virus (NDV) infection,which causes high morbidity and mortality. In this study,six NDV strains were isolated from the pigeon tissue samples,four of which were highly virulent and two were low virulent. These pigeon viruses were cloned 5 times in embroynated SPF chicken eggs via limited dilution method. The fresh allantoic fl uids were collected for RNA extraction. The resulting RNA samples were converted to cDNAs followed by PCR amplification and sequencing of F and HN genes. Phylogenetic analysis based on F gene sequences showed that four highly virulent strains belonged to Class Ⅱ Ⅵb subgenotype and two low virulent strains were similar to La Sota and belonged to Class Ⅱ genotype Ⅱ. In addition,four highly virulent strains were more closely related to the strain isolated in Italy a few years ago than those strains obtained in China in 1990’s. Therefore,these virulent pigeon strains currentlyprevailing in China might originate from Europe. Bioinformatics analysis revealed that a linear epitope consisting of amino acids 345-353 on HN protein of these pigeon strains changed as compared with the classic vaccine strain La Sota. In addition,hemagglutination inhibition revealed a noticeable difference between these pigeon strains and La Sota. The results support that chicken vaccine strains do not effectively protect pigeons from NDV infection thus the vaccines designed for pigeon use are much needed.

Newcastle disease virus; pigeon; genotype Ⅵb; F gene; HN gene

S852.659.5

A

1674-6422（2014）05-0001-09

2014-02-17

863計(jì)劃(2011AA10A209)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303033，201003012）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013JB03）

李仕超，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn