不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對雞免疫功能的影響

鄭 蓓，趙 翠，宋道楨，付石軍，常維山

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271000；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對雞免疫功能的影響

鄭 蓓1，趙 翠1，宋道楨2，付石軍2，常維山1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271000；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

本文旨在研究不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對雞免疫功能的作用，以確定臨床上地塞米松的用量上限及尋找一種效果較好的免疫調(diào)節(jié)劑。將10日齡雞隨機分為對照組、0.1、0.5、1.5 mg/kg· BW地塞米松組，通過飲水添加地塞米松，檢測多種免疫指標。結(jié)果表明地塞米松可影響正常雞的免疫功能， 0.1、0.5、1.5 mg/kg· BW地塞米松均可極顯著抑制雞外周血T淋巴細胞增殖（P＜0.01），但對B淋巴細胞無明顯影響；0.5、1.5 mg/kg· BW地塞米松可極顯著抑制雞白細胞介素-2的活性（P＜0.01）；0.5、1.5 mg/kg· BW地塞米松組的新城疫抗體水平顯著低于對照組（P＜0.05）；0.5、1.5 mg/kg·BW地塞米松組淋巴細胞比率顯著低于對照組（P＜0.05）；地塞米松組的雞總體重、免疫器官及法氏囊指數(shù)顯著低于對照組。將10日齡雞隨機分為4組，分別為對照組、干擾素組、干擾肽組和胸腺肽組，試驗前5 d所有組飲水中均添加0.5 mg/kg· BW地塞米松，5 d后各組分別在飲水中添加相應的免疫調(diào)節(jié)劑，試驗結(jié)束后檢測免疫指標。結(jié)果表明：干擾素、胸腺肽組的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率極顯著高于對照組（P＜0.01）；胸腺肽組的新城疫抗體水平顯著高于對照組（P＜0.05），白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)極顯著高于對照組（P＜0.01），總體重顯著高于對照組（P＜0.05）；干擾素組的脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗結(jié)果說明當?shù)厝姿傻挠昧砍^0.5 mg/kg· BW可抑制雞的免疫功能，而干擾素和胸腺肽對雞群有免疫調(diào)節(jié)作用，可在一定程度上提高雞群的免疫力。

地塞米松；雞；免疫功能；免疫調(diào)節(jié)

由各種應激因素引起的免疫應激會導致血液中糖皮質(zhì)激素的含量顯著上升，抑制機體的細胞免疫功能，使機體的免疫力降低，導致動物生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。引發(fā)免疫抑制產(chǎn)生的原因很多，其中地塞米松的濫用導致的免疫抑制雖然不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀[2]，但是造成的潛在后果特別嚴重，給生產(chǎn)造成的持續(xù)損失也比較長久[3]。地塞米松被廣泛應用于獸醫(yī)臨床疾病防治中，并且收到了很好的效果[4]。然而，很多使用地塞米松治愈的雞又很容易感染其他疾病死亡，而且很多是已經(jīng)免疫過的疾病[5]?，F(xiàn)在，對地塞米松的大量使用甚至濫用已經(jīng)引起了人們的極大關注[6]。地塞米松嚴重損害了動物機體的生長代謝及免疫功能，使家禽對多種病原菌的免疫應答能力降低甚至消失[7,8]，導致家禽疾病的發(fā)病率和治療難度增加，造成了巨大的經(jīng)濟損失[9]。

針對此種現(xiàn)象，本試驗通過給予雞群不同劑量的地塞米松，檢測地塞米松對雞群各項免疫指標的影響，觀察地塞米松對正常雞免疫功能的影響，用藥的劑量與抑制程度是否有關系，為臨床合理使用地塞米松提供科學依據(jù)，避免地塞米松的不合理使用帶給養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟損失。同時構(gòu)建地塞米松對雞免疫抑制的模型。

養(yǎng)雞業(yè)是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中一個重要支柱產(chǎn)業(yè)，伴隨其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，市場占有比例的不斷提高，為了創(chuàng)造更大的經(jīng)濟效益，降低養(yǎng)殖成本，減少經(jīng)濟損失，雞的疫病防治成為了人們關注的焦點[10]。當前多種因素都會造成動物機體的免疫抑制，進而繼發(fā)多種病原微生物的感染，多病齊發(fā)給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的損失[11]。隨著科技水平的提高，免疫增強劑的作用越來越受到重視，特性確定、高效穩(wěn)定、無毒無殘留的免疫增強劑是未來疾病防疫的重要物品 。免疫增強劑的種類多達上百種，現(xiàn)在市場上常用的免疫調(diào)節(jié)劑的效果如何，能否增強機體的免疫力。本文選取了胸腺肽、干擾素和微生態(tài)制劑干擾肽做臨床試驗，以選取效果較好的免疫調(diào)節(jié)劑指導生產(chǎn)應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑10日齡肉雞購自某養(yǎng)雞場。1640培養(yǎng)液購自Thermo賽默飛世爾生物化學制品有限公司；犢牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司；淋巴細胞分離液、ConA、LPS、MTT購自Sigma公司；Wright-Giemsa 混合染液購自Solarbio公司；雞干擾素-γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司；干擾素購自四川世紅生物技術(shù)有限公司；干擾肽購自大連三儀動物藥品有限公司；胸腺肽購自辰欣藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將10日齡雞隨機分為3組地塞米松實驗組和1組空白對照組。實驗組分別按每天每只雞0.1、0.5、1.5 mg/kg·BW飲水給藥，早晚各1次。其余飼養(yǎng)條件實驗組和對照組相同。

在10日齡雞群飲水中添加0.5mg/kg·BW地塞米松，連用5 d后，將雞群隨機分為4組，分別為對照組、干擾素組、干擾肽組和胸腺肽組，在飲水中添加相應的免疫調(diào)節(jié)劑。試驗結(jié)束后，檢測免疫指標。

1.2.2 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 無菌采取雞肝素抗凝血，常規(guī)方法分離外周血淋巴細胞，用1640培養(yǎng)液配成1×107/mL淋巴細胞懸液。96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入淋巴細胞懸液100 μL。分別加入ConA（終濃度45 μg/mL）或LPS（終濃度25 μg/mL）。將培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)56 h，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入0.04 mol/L酸化異丙醇100 μL，在波長490 nm處測定OD值。

1.2.3 脾臟T淋巴細胞IL-2體外誘生 將實驗雞迫殺，無菌取脾臟，研磨，以淋巴細胞分離液密度梯度離心分離淋巴細胞，制備活細胞率＞95%的1640單細胞懸液。于24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入1×107/mL單細胞懸液1 mL，含2.5 μg/mL ConA的1640完全營養(yǎng)液1 mL。置5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，20 h后取出細胞培養(yǎng)板，將培養(yǎng)液移入離心管內(nèi)2000×g離心20 min，收取上清液，－20℃凍存?zhèn)錂z。

雞外周血T淋巴細胞產(chǎn)生的白細胞介素-2 （IL-2）活性的檢測：取正常雞脾臟，分離淋巴細胞，制備靶細胞懸液，培養(yǎng)48 h。96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL待測樣品及100 μL靶細胞懸液，37℃培養(yǎng)18 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入酸化異丙醇，測定OD490值。

1.2.4 新城疫抗體水平檢測 對13日齡雞群點眼滴鼻接種新城疫疫苗，2 d后采血分離血清，常規(guī)血凝抑制方法檢測血清中新城疫抗體水平。

1.2.5 血清中IFN-γ含量測定 參照雞干擾素-γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長讀數(shù)。

1.2.6 白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)及淋巴細胞比率 翅膀靜脈采集抗凝血，血細胞分析儀讀數(shù)。

1.2.7 免疫器官指數(shù) 試驗結(jié)束后雞空腹稱活體重，然后進行屠宰，分離出免疫器官（脾臟和法氏囊），并立即分別稱其新鮮重量。免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重/活體重×100。

1.2.8 白細胞吞噬功能檢測 在肝素抗凝血中加入葡萄球菌，37℃孵育1～2 h，每隔10 min輕輕晃動1次。取孵育液滴于載玻片上，推成薄片，待自然干后用Wright-Giemsa 混合染液染色，蒸餾水輕輕沖去染液，自然晾干。油鏡鏡檢，記數(shù) 100 個以上白細胞，并計算白細胞吞噬率：吞噬細胞百分率（%）= 吞噬細菌的中性粒細胞數(shù)÷吞噬和未吞噬的中性粒細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對雞外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響從表1可以看出，0.1、0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率極顯著低于對照組（P＜0.01），用藥組和對照組B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率差異不具有顯著統(tǒng)計學意義。干擾素組和胸腺肽組的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率極顯著高于對照組（P＜0.01），干擾素組的B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組（P＜0.05）。說明地塞米松可降低T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，干擾素可提高T淋巴細胞和B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，胸腺肽對T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率也有促進作用。

2.2 地塞米松對誘生雞外周血淋巴細胞IL-2活性的影響從表2可以看出，0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的IL-2活性極顯著低于對照組（P＜0.01）。說明大劑量的地塞米松可降低雞外周血淋巴細胞IL-2的活性。干擾素組、干擾肽組和胸腺素組的IL-2略高于對照組，但差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

表2 不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對雞外周血淋巴細胞IL-2活性的影響Table 2 Effects of different levels of dexamethasone and different immune modulators on the IL-2 activity in chickens

2.3 新城疫抗體水平0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的抗體效價顯著低于對照組（P＜0.05）。胸腺肽組的效價顯著高于對照組（P＜0.05）。說明大劑量的地塞米松可降低血清中新城疫抗體的效價。胸腺肽可提高血清中新城疫抗體的效價，提高機體抵抗新城疫病毒的水平（表3）。

表3 不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對新城疫抗體效價的影響Table 3 Effects of different levels of dexamethasone and different immune modulators on the Newcastle disease antibody activity in chickens

2.4 血清中IFN-γ含量檢測結(jié)果顯示0.1、0.5 mg/kg·BW用藥組的IFN-γ含量略高于對照組，1.5 mg/kg·BW用藥組的IFN-γ含量略低于對照組，但是差異均無顯著性統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對免疫抑制的雞群使用不同免疫調(diào)節(jié)劑后，各組的IFN-γ含量差異也不具有顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

2.5 白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)及淋巴細胞比率從表5可以看出，0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的淋巴細胞比率顯著低于對照組（P＜0.05）。胸腺肽組的白細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明高劑量的地塞米松可降低白細胞中淋巴細胞的比率。胸腺肽可提高血液中白細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)，白細胞是機體的一項重要免疫指標，說明胸腺肽可提高機體的免疫力。

表4 不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對血清中IFN-γ含量的影響Table 4 Effects of different levels of dexamethasone and different immune modulators on IFN-γ content in chickens

表5 血液中白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)及淋巴細胞比率Table 5 Numbers of white blood cells,lymphocyte count and lymphocyte ratio in the blood

2.6 免疫器官指數(shù)脾臟和法氏囊作為禽的重要免疫器官，它們的器官指數(shù)可直接反映免疫器官的發(fā)育狀態(tài)。本試驗結(jié)果顯示，在地塞米松作用下，0.1、0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的總體重顯著低于對照組（P＜0.05），0.1、1.5 mg/kg·BW用藥組的脾臟重量顯著低于對照組（P＜0.05），0.1、0.5、1.5 mg/kg· BW用藥組的法氏囊重量極顯著低于對照組（P＜0.01），0.1、0.5、1.5 mg/kg·BW用藥組的法氏囊指數(shù)極顯著低于對照組（P＜0.01）。由此說明在地塞米松的作用下， 免疫器官的發(fā)育阻滯。胸腺肽組的總體重顯著高于對照組（P＜0.05），干擾素組的脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。地塞米松可抑制免疫器官脾臟和法氏囊的正常發(fā)育，而通過添加干擾素或胸腺肽可在一定程度上對免疫器官的正常發(fā)育起到促進作用（表6）。

2.7 白細胞吞噬實驗從表7可以看出，用藥組的白細胞吞噬率和對照組差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干擾素組、胸腺肽組、干擾肽組的白細胞吞噬率和對照組差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

表6 總體重、免疫器官重量及免疫器官指數(shù)Table 6 The overall weight,immune organ weight and organ index

表7 不同劑量地塞米松及不同免疫調(diào)節(jié)劑對雞血液白細胞吞噬功能的影響Table 7 Effects of different levels of dexamethasone and different immune modulators on leukocyte phagocytosic activity in chickens

3 討論

當動物機體受到各種有害刺激時體內(nèi)糖皮質(zhì)激素會相應升高，從而導致機體的免疫抑制[13,14]。地塞米松用量的確定極其重要，超過安全劑量后地塞米松可引起免疫抑制[15,16]。孫雷等[17]通過自由飲水方式給予雞群不同劑量地塞米松，測定新城疫和傳染性法氏囊病病毒的抗體效價，結(jié)果表明在較小劑量 0.5 mg/kg/d時影響不大，但在大劑量≥1.0 mg/kg/d時已有顯著的抑制作用，影響免疫效果。操繼躍等[18]分別向免疫期間的各組雞群給予不同劑量的地塞米松后，對雛雞新城疫病毒和傳染性法氏囊病病毒抗體滴度進行監(jiān)測。結(jié)果表明小劑量（0.1 mg/kg）地塞米松對抗體滴度影響不顯著，而中、大劑量地塞米松可使肉雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒的抗體滴度顯著低于對照組。地塞米松對雞的臨床用藥推薦劑量約為0.1 mg/kg，可見若嚴格按推薦劑量給藥，則對體液免疫無顯著影響，但當用量在0.5 mg/kg以上時，便會造成明顯的免疫抑制，直接造成免疫失敗，會給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的損失。因此，臨床上使用地塞米松時應嚴格控制劑量。

本研究通過飲水給予雞群地塞米松后，通過各項免疫指標的檢測觀察雞群的免疫力的變化，更全面分析得出地塞米松的安全使用量。通過試驗發(fā)現(xiàn)，地塞米松試驗組的雞的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、IL-2活性、新城疫抗體水平、淋巴細胞比率、法氏囊指數(shù)等免疫指標顯著低于正常對照組的雞。試驗結(jié)果可以說明，飲水中添加地塞米松可降低雞的免疫力。建議在臨床應用中不要濫用地塞米松去治療雞的疾病，用量超過每天0.5 mg/kg·BW時會顯著引起免疫力降低，容易導致其他疾病的發(fā)生。

在實際生產(chǎn)中有很多因素能導致家禽產(chǎn)生免疫抑制，并給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。因此建立適度而穩(wěn)定的免疫抑制模型對研究免疫增強劑至關重要[19]。研究結(jié)果說明，按照0.5 mg/kg/d的劑量飲水給予地塞米松能夠復制出較理想的免疫抑制模型。

目前國內(nèi)外關于雞干擾素給藥方式對抗體產(chǎn)生的報道，多以注射給藥為主，不適合臨床推廣[20]。有資料表明，以雞的胸腺提取液喂雞，能促進外周血淋巴細胞的生長。單獨使用胸腺肽對雞新城疫和傳染性支氣管炎的治愈率達到70%以上，胸腺肽對雞新城疫病毒和傳染性喉氣管炎病毒強毒混合感染的小雞有一定的預防與治療作用。已有研究表明使用乳酸 L-68 糞腸球菌制劑在動物腸道內(nèi)增殖時，能改善腸道內(nèi)環(huán)境促進動物健康，通過添加乳酸 L-68糞腸球菌對改善雞健康狀況和飼養(yǎng)環(huán)境方面有初步外觀表現(xiàn)。對肉雞的免疫增強作用方面，乳酸L-68糞腸球菌能明顯提高循環(huán)血液中的抗體水平。

本試驗選擇胸腺肽、干擾素和微生態(tài)制劑干擾肽，通過飲水口服添加給予雞群，研究它們對機體免疫功能的影響。干擾素、胸腺肽組的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率極顯著高于對照組，胸腺肽組的新城疫抗體水平、白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、總體重顯著高于對照組，干擾素組的脾臟指數(shù)顯著高于對照組，說明干擾素和胸腺肽對雞群有免疫調(diào)節(jié)作用，可提高雞群的免疫力。結(jié)果表明干擾素和胸腺肽可以在一定程度上緩解由地塞米松引起的免疫抑制，恢復由地塞米松引起的免疫力降低。因此在臨床上用地塞米松治療疾病痊愈后，或者其他因素引起的免疫抑制病，可以在飲水中添加干擾素和胸腺肽等免疫調(diào)節(jié)劑，以恢復或提高機體免疫力，增強機體對其他疾病的抵抗力。

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EFFECTS OF DIFFERENT DOSES OF DEXAMETHASONE AND DIFFERENT IMMUNE MODULATORS ON IMMUNE RESPONSES IN CHICKENS

ZHENG Bei1,ZHAO Cui1,SONG Dao-zhen2,FU Shi-jun2,CHANG Wei-shan1
(1. College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Tai'an 271000,China; 2. Shandong Binzhon Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

The present study focused on effect of different doses of dexamethasone on the immune functions of chickens. Ten-day-old chickens were orally administered with 0.1,0.5 or 1.5 mg/kg·BW dexamethasone,respectively,and a number of immune indexes were tested. The result showed that dexamethasone affected normal immune functions in chickens. Dexamethasone suppressed proliferative capacity of T lymphocytes in chicken peripheral blood but had no obvious effect on B lymphocytes. In addition,dexamethasone inhibited activity of interleukin-2 in chickens. The Newcastle disease antibody level was low in dexamethasone treated chickens. The Lymphocyte ratios and chickens’ overall weights,immune organ indexes and fabricius of bursa in dexamethasone treated chickens were lower thanthose of non-treated control group. These results showed that 0.5,1.5 mg/kg· BW dexamethasone inhibited immune functions of chickens. In the next study,ten-day-old chickens were given drinking water containing dexamethasone at 0.5 mg/kg·BW for consecutive 5 days and then interferon,interferon-like peptide or thymus peptide were added to the water. T lymphocyte conversion rates in chickens receiving thymus peptide and interferon were signifi cantly higher than that of non-treatment controls,indicating their immunoregulatory role.

Dexamethasone; chicken; immunity; immunoregulation

S859.793

A

1674-6422（2014）05-0054-07

2014-04-01

山東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊崗位科學家研究經(jīng)費（SDAIT-13-011-11）

鄭蓓，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

常維山，E-mail：1651542031@qq.com