偽狂犬病毒變異株（JS-2012）對(duì)仔豬的致病性研究

童 武，鄭 浩，單同領(lǐng)，劉 飛，梁 超，李國(guó)新，姜一峰，于 海，高 飛，周艷君，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

偽狂犬病毒變異株（JS-2012）對(duì)仔豬的致病性研究

童 武，鄭 浩，單同領(lǐng)，劉 飛，梁 超，李國(guó)新，姜一峰，于 海，高 飛，周艷君，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本實(shí)驗(yàn)室2012年從江蘇省太倉(cāng)市某發(fā)病豬場(chǎng)分離到1株變異的偽狂犬病毒，命名為JS-2012。為了研究該分離株對(duì)仔豬的致病性，將12頭15日齡的偽狂犬病毒陰性仔豬隨機(jī)分為3組，其中2組（每組5頭豬）分別通過(guò)肌肉注射和滴鼻接種JS-2012毒，第3組2頭豬做空白對(duì)照。接種病毒的仔豬在攻毒后24 h體溫均開(kāi)始升高，4 d后開(kāi)始死亡，死亡率為100%。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，滴鼻組仔豬發(fā)病死亡明顯快于肌肉注射組。對(duì)病死豬進(jìn)行剖解，均可見(jiàn)大腦血管擴(kuò)張并出血等典型的偽狂犬病病理變化。病理切片顯示豬的腦蛛網(wǎng)膜下腔嚴(yán)重出血，其他各臟器也均有嚴(yán)重病理變化。結(jié)果表明該變異株JS-2012為偽狂犬強(qiáng)毒毒株。

偽狂犬病毒；JS-2012；仔豬；致病性

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病[1]。偽狂犬病毒能感染多種宿主，但豬是該病毒的主要天然宿主、貯存者和傳播者[1,2]。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，及種豬不育。偽狂犬病最早發(fā)生于美國(guó)，我國(guó)20世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了偽狂犬病毒，60年代初在豬群中也出現(xiàn)該病毒流行，至今偽狂犬病毒仍在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)豬群的健康[3]，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4]。

我國(guó)豬場(chǎng)自20世紀(jì)末開(kāi)始使用偽狂犬基因缺失疫苗，豬偽狂犬發(fā)病率明顯下降。但自2011年以來(lái)，許多使用gE基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等偽狂犬的臨床癥狀。童武等[5]、彭金美等[6]分別從發(fā)病豬場(chǎng)分離到了偽狂犬病毒，并證實(shí)了流行毒較經(jīng)典毒發(fā)生了較大變異。然而，這種變異的偽狂犬病毒對(duì)哺乳仔豬的致病性還不十分清楚，為此，我們開(kāi)展了本項(xiàng)研究。

1 材料與方法

1.1 病毒、實(shí)驗(yàn)豬本研究所用的病毒（PRV JS-2012株，TCID50=10-6/0.1mL）由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。實(shí)驗(yàn)仔豬來(lái)源于浙江省紹興市嵊州市某豬場(chǎng)，均為偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classic swine fever virus，CSFV）和圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）陰性，且通過(guò)IDEXX抗體試劑盒檢測(cè)證實(shí)偽狂犬病毒gB、gE抗體也均為陰性。

1.2 試劑、細(xì)胞LATaqDNA聚合酶、dNTP mix、2×GC Buffer I、DNA Marker （DL 2000）等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；Vero細(xì)胞由上海獸醫(yī)研究所豬病實(shí)驗(yàn)室保存，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；gB、gE抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、接種將15日齡的實(shí)驗(yàn)仔豬12頭隨機(jī)分成3組，第一組5頭（編號(hào)：1、2、3、4、5）均通過(guò)頸部肌肉接種PRV JS-2012毒2 mL，分別含2×107TCID50（1、2）、1×106TCID50（3、4、5）。第二組5頭（編號(hào)：6、7、8、9、10）通過(guò)滴鼻接種PRV JS-2012毒 2 mL，分別含2×107TCID50（6、7）、106TCID50（8、9、10）。第三組2頭（編號(hào)：D1、D2）作空白對(duì)照。開(kāi)始時(shí)2號(hào)和9號(hào)豬精神狀態(tài)較其他豬弱，所用JS-2012株病毒均為第3代細(xì)胞培養(yǎng)毒，其滴度為：TCID50=10-6/0.1mL。

1.4 臨床觀察在攻毒前及攻毒后d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13分別對(duì)每頭仔豬進(jìn)行采血（死亡的除外）。攻毒后每天觀察2次，測(cè)量體溫1次并記錄臨床癥狀。

1.5 病理觀察對(duì)試驗(yàn)中發(fā)病死亡或試驗(yàn)結(jié)束迫殺的仔豬，進(jìn)行病理剖檢并觀察病變。每頭豬取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織，用10% 中性福爾馬林固定，委托上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司負(fù)責(zé)病理切片的制作。

1.6 病料檢測(cè)對(duì)所采血樣進(jìn)行g(shù)B、gE抗體檢測(cè)。所有仔豬的腦組織用gB、gE[5]的特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。將處理好的病料接種Vero細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀攻毒后d1，攻毒組所有仔豬體溫均開(kāi)始升高；d2，攻毒組所有仔豬體溫均在40.5℃以上，且2號(hào)豬有明顯的奇癢、走路搖晃等癥狀；d3，攻毒組仔豬均發(fā)燒至41℃以上，且2、9號(hào)豬有明顯的神經(jīng)癥狀；d 4上午9號(hào)豬死亡，2號(hào)豬瀕死、四肢呈劃水狀，6、7、8、10號(hào)發(fā)病，均有共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，且10號(hào)豬出現(xiàn)頻繁用頭撞墻動(dòng)作；d 4下午，2、6、7號(hào)豬死亡；d 5，8、10號(hào)死亡，其他精神狀態(tài)均不好；d 6，5號(hào)豬死亡，其他豬精神狀態(tài)均較差；d 7，1號(hào)豬死亡，3號(hào)豬瀕死，4號(hào)豬有間歇性神經(jīng)癥狀及突然倒地抽搐；d 9，3號(hào)豬死亡，4號(hào)豬瀕死；d 11，4號(hào)豬死亡。D1，D2豬從始至終均很健康，d 11強(qiáng)制殺死。根據(jù)測(cè)得實(shí)驗(yàn)豬體溫?cái)?shù)據(jù)，繪制攻毒后豬體溫變化圖（圖1）。攻毒后，兩種接種途徑的豬體溫均快速升高。而不同接種途徑對(duì)試驗(yàn)豬死亡進(jìn)程則有較大影響，滴鼻接種組比肌肉接種組死亡快，且整齊（圖2）

2.2 剖解及PCR檢測(cè)病死的實(shí)驗(yàn)仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂。剖檢見(jiàn)腦脊液明顯增多，腦膜腫脹增厚、血管擴(kuò)張，并伴隨出血；肺臟輕度氣腫，并伴有出血，壞死；腹股溝淋巴結(jié)明顯充血腫脹；脾臟邊緣明顯淤血且腫大；腎臟可見(jiàn)點(diǎn)狀出血；肝臟邊緣淤血壞死。對(duì)照組各組織臟器均未見(jiàn)明顯病理變化（圖3），表明PRV JS-2012株的感染對(duì)豬的多個(gè)重要器官產(chǎn)生了侵害作用。攻毒組10頭豬的腦樣品，用PRVgB（633 bp）和gE（366 bp）的特異性引物分別擴(kuò)增出了相應(yīng)的基因片段（圖4），接種Vero細(xì)胞后也均能產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變，提示PRV JS-2012株侵入了所有感染豬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

圖1 攻毒后豬的體溫變化Fig.1 Body temperature changes of piglets post infection with PRV JS-2012

圖2 攻毒后各組豬不同時(shí)間的存活情況Fig.2 Mortality of piglets post infection with PRV JS-2012

圖3 攻毒組及空白對(duì)照組剖解后的眼觀病變Fig.3 The autopsy lesions of piglets in infection group and control group

圖4 攻毒組及空白對(duì)照組腦組織gB、gE基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR-amplifi ed gB and gE gene from brains of infection group and control group

2.3 組織病理切片觀察對(duì)攻毒組死亡或?qū)嶒?yàn)結(jié)束迫殺的對(duì)照組仔豬進(jìn)行解剖。每頭豬取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)組織，用10% 中性福爾馬林固定，進(jìn)行病理切片制作。病理切片顯示，攻毒組的豬腦蛛網(wǎng)膜下腔嚴(yán)重出血且腦水腫；淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞顯著減少；肝細(xì)胞有空泡性變性；肺臟有嚴(yán)重瘀血，出血；腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性并出血；脾臟淋巴細(xì)胞顯著減少。對(duì)照組各組織臟器均未見(jiàn)明顯病理變化（圖5）。

圖5 攻毒組及空白對(duì)照組不同組織的病理切片觀察（HE 200×）Fig.5 Pathological section observation of differet tissues in pigets of infection group and control group（HE 200×）

3 討論

PRV感染仔豬，可呈現(xiàn)出不同臨床癥狀。張桂云等[7]用PRV北京分離株接種7日齡健康仔豬，能引起仔豬死亡。但死亡豬的腎臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)均未見(jiàn)明顯眼觀病理變化，且整個(gè)病程中豬的體溫都沒(méi)有升高。在本研究中，PRV JS-2012感染15日齡健康仔豬，24 h后體溫都明顯升高，且能引起接種豬急性死亡。剖解后可見(jiàn)腦嚴(yán)重出血，水腫；肺臟輕度氣腫，并伴有出血，壞死；腹股溝淋巴結(jié)明顯充血腫脹；脾臟邊緣明顯淤血且腫大；腎臟可見(jiàn)點(diǎn)狀出血；肝臟邊緣淤血壞死。病理切片也顯示，攻毒組的豬腦蛛網(wǎng)膜下腔嚴(yán)重出血且腦水腫；淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞顯著減少；肝細(xì)胞有空泡性變性；肺有嚴(yán)重瘀血，出血；腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性并出血；脾臟淋巴細(xì)胞顯著減少。而對(duì)照組仔豬從始至終均很健康，剖殺后剖解各組織臟器均未見(jiàn)明顯眼觀病理變化，組織切片觀察也未見(jiàn)明顯病理變化。PRV毒力不同，感染仔豬后在體內(nèi)的分布也不相同。谷長(zhǎng)勤等[8]研究表明，PRV強(qiáng)毒感染后，病毒在全身均有分布，而弱毒株及中等毒力的毒株感染后病毒只分布于局部中樞神經(jīng)等。JS-2012株接種豬后，能侵害多種主要器官，并造成肉眼可見(jiàn)的損傷，這顯示JS-2012株是一株強(qiáng)毒株。

接種JS-2012株后24 h，兩攻毒組仔豬的體溫均開(kāi)始升高，4 d后兩組仔豬開(kāi)始死亡，滴鼻組到d5全部死亡，肌肉注射組分別在d4，6、7、9、11時(shí)各死亡1頭仔豬。雖然兩攻毒組的死亡率均為100%，但滴鼻接種組的發(fā)病及死亡速度明顯快于肌肉注射組。張斌等[9]、張桂云等[7]研究證實(shí)PRV不同毒株不同感染途徑對(duì)仔豬的致病率是不同的，這與本研究結(jié)果相同。

滴鼻組6、7號(hào)豬接種病毒量是8、9、10號(hào)豬的20倍，攻毒后6、7號(hào)豬發(fā)病死亡速度較8、9（實(shí)驗(yàn)前狀態(tài)略差）、10快。同樣在肌肉注射組也呈現(xiàn)這一趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明，不管何種接種途徑，就接種劑量來(lái)看，接種劑量大的仔豬發(fā)病及死亡的速度也快。

本研究證實(shí)JS-2012毒株對(duì)哺乳仔豬的致病性非常強(qiáng)，致死率高達(dá)100%，且滴鼻接種的致死性要明顯高于肌肉注射。這一結(jié)果為下一步研制基因缺失弱毒疫苗提供了數(shù)據(jù)支持，且為后續(xù)基因缺失弱毒疫苗的免疫評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)提供了攻毒模型。

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PATHOGENICITY OF VARIANT STRAIN JS-2012 OF PSEUDORABIES VIRUS IN PIGLETS

TONG Wu,ZHENG Hao,SHAN Tong-ling,LIU Fei,LIANG Chao,LI Guo-xin,JIANG Yi-feng,YU Hai,GAO Fei,ZHOU Yan-jun,TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China)

In December 2012,a variant strain JS-2012 of porcine Pseudorabies virus (PRV) was isolated from a diseased piglet in Taicang city Jiangsu Province. To study the pathogenicity of JS-2012,twelve 15-day-old PRV-free piglets were divided into 3 groups：intramuscular injection group (5 piglets),intranasal inoculation group (5 piglets) and non-treatment control group (2 piglets). At 24 h post infection,body temperature of piglets in ten 15-day-old inoculation piglets in two infection groups increased. At day 4 post infection,piglets in both infected group started to die. The intranasal group died faster than those in intramuscular injection group although the mortality of both infection groups was 100%. Dead piglets were necropsied for pathological examination. Vasodilatation and angiorhagia were found in brain,which were typical lesions caused by PRV. Severe subarachnoid hemorrhage and lesions in other organs were also recorded. In conclusion,JS-2012 was a virulent PRV variant.

Pseudorabies virus; JS-2012; piglets; pathogenicity

S852.659.1

A

1674-6422（2014）05-0010-05

2014-06-30

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14ZR1448900)；中央科研院所公益性基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2014JB02）；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

童武，男，碩士，實(shí)習(xí)研究員，主要從事豬偽狂犬病研究工作

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn