慢性間歇低氧對(duì)小鼠骨密度和骨代謝的影響

朱再勝　黃卡特　鄭靖宇　戴爽　吳玲　杜曉紅　李劍敏

慢性間歇低氧對(duì)小鼠骨密度和骨代謝的影響

朱再勝黃卡特鄭靖宇戴爽吳玲杜曉紅李劍敏

【摘要】目的探討慢性間歇低氧（CIH）對(duì)骨密度（BMD）和骨代謝的影響。方法將16只12周齡C57BL/6雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為慢性間歇低氧組（CIH組）和正常對(duì)照組（CON組），每組8只。CON組小鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，CIH組小鼠在間歇低氧環(huán)境下飼養(yǎng)，低氧暴露時(shí)間為每日9:00～17:00，6d/周，共8周。于8周末取血，用ELISA法測(cè)定血清抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、骨鈣素（OC）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；取右側(cè)股骨檢測(cè)其BMD；取左側(cè)股骨觀察骨組織形態(tài)學(xué)改變，并分別采用免疫組化和real-time qPCR法檢測(cè)骨保護(hù)蛋白（OPG）和核因子-κβ受體活化因子配體（RANKL）和其mRNA表達(dá)。結(jié)果與CON組相比，CIH組小鼠BMD、血清OC水平及OPG/RANKL mRNA比值均明顯下降（P＜0.05或0.01），而血清TRACP-5b、IL-6和TNF-α水平、骨組織內(nèi)RANKL和mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.05或0.01）；但骨組織內(nèi)OPG和mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；小鼠股骨干骺端骨小梁分布稀疏，變細(xì)及斷裂。血清IL-6水平與BMD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與骨組織RANKL mRNA呈正相關(guān)（P＜0.01）；血清TNF-α水平與BMD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與骨組織RANKL mRNA呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論CIH能導(dǎo)致骨吸收增加、骨形成下降和BMD下降，與低氧以及CIH引起的IL-6、TNF-α水平升高導(dǎo)致RANKL升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞 】間歇低氧骨代謝骨密度骨保護(hù)蛋白核因子-κβ受體活化因子配體

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生以骨折為特征的全身性代謝性骨病。骨質(zhì)疏松癥患者在日?；顒?dòng)中的輕微創(chuàng)傷往往就能引發(fā)骨折，產(chǎn)生致畸、致殘甚至死亡等嚴(yán)重后果。任何原因引起成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收偶聯(lián)的動(dòng)態(tài)失平衡是導(dǎo)致骨再建的病理生理基礎(chǔ)，當(dāng)骨吸收強(qiáng)于骨形成時(shí)，則出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥。目前研究顯示高原環(huán)境持續(xù)低氧可使機(jī)體骨代謝異常、骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨密度（bone mineral density，BMD）下降，發(fā)生骨質(zhì)疏松[1]。然而，諸如睡眠呼吸暫停綜合征、航空旅行和反復(fù)高海拔回到海平面所引起的慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是否影響骨質(zhì)代謝的失平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生，目前國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果并未達(dá)成共識(shí)[2-4]。筆者采用CIH小鼠模型，研究CIH對(duì)骨代謝、BMD、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及骨組織骨保護(hù)蛋白（OPG）、核因子-κβ受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)的影響，同時(shí)探討CIH導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1材料SPF級(jí)健康12周齡雄性C57BL/6小鼠16只,體重19.5～24.0g，平均（22.5±1.1）g；由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK（浙）2010-0150。免疫組化試劑：OPG和RANKL兔抗小鼠多克隆抗體（一抗，武漢博士德生物工程有限公司）；realtime qPCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen life technologies）；OPG、RANKL及內(nèi)參GAPDH引物（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；骨鈣素（OC）、抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、IL-6和TNF-α等ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為慢性間歇低氧組（CIH組）和正常對(duì)照組（CON組），每組8只。CON組置于正常環(huán)境飼養(yǎng)，CIH組置于常壓低氧艙中飼養(yǎng)，維持艙內(nèi)氧積分?jǐn)?shù)8%～11%，CO2濃度1%～3%[5]，低氧暴露時(shí)間為每日8h（9：00～17：00），6d/周，連續(xù)8周。兩組小鼠自由飲食，每周測(cè)量體重1次。

1.3標(biāo)本采集在實(shí)驗(yàn)8周末，斷頭處死小鼠，取血1～1.5ml，靜置、離心、分離血清，取血清置-80℃低溫保存待用。每組隨機(jī)取4只小鼠的左側(cè)股骨，采用中性福爾馬林液固定24h，取出后置20%EDTA溶液中4℃脫鈣，3d換液1次，直至大頭針能順利刺入骨組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，用于組織形態(tài)學(xué)觀察；取其余4只小鼠的左側(cè)股骨，置-80℃保存用于real-time qPCR檢測(cè)。取所有小鼠的右側(cè)股骨，用浸有0.9%氯化鈉溶液的濕紗布包裹，-20℃低溫保存，測(cè)定BMD。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1OC、TRACP-5b、IL-6和TNF-α檢測(cè)采用ELISA法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

1.4.2BMD測(cè)定取出-20℃保存的右側(cè)股骨，應(yīng)用QDR-4500型骨密度儀小動(dòng)物軟件（美國(guó)Hologic公司）程序掃描整段股骨的BMD，其重復(fù)測(cè)量的內(nèi)在變異率在1.7%～2.0%。

1.4.3骨組織形態(tài)學(xué)觀察及OPG、RANKL表達(dá)強(qiáng)度取左側(cè)股骨石蠟包埋組織，采用連續(xù)間隔切片，厚度5μm，取1張行HE染色，光鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)；另各取5張分別行OPG、RANKL免疫組化染色，油鏡下觀察OPG、RANKL的表達(dá)變化。用PBS緩沖液取代一抗（濃度均為1：100）作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)取不重復(fù)5個(gè)視野，并在油鏡下（1 000倍）攝像。每個(gè)視野均進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分和著色強(qiáng)度記分[6]。結(jié)果判定方法如下：陽(yáng)性細(xì)胞百分比記分：≤25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別記分為l、2、3、4分。著色強(qiáng)度記分：按陽(yáng)性細(xì)胞著色（顏色）無(wú)、弱（淡黃）、中（棕黃）、強(qiáng)（棕褐）分別記分為0、1、2、3分。上述兩種記分結(jié)果相加，1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分中等陽(yáng)性（++），6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。兩組間OPG、RANKL表達(dá)強(qiáng)度的比較以陰性或陽(yáng)性強(qiáng)度占切片的相對(duì)數(shù)表示。

1.4.4OPG、RANKL和GAPDH mRNA表達(dá)取-80℃保存的股骨標(biāo)本，采用Trizol一步法提取總RNA。通過(guò)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的RNA完整性，紫外吸收測(cè)定法鑒定RNA的純度，選擇完整性和純度均符合試驗(yàn)要求的RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用real-time qPCR相對(duì)定量法，比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt方法，得出mRNA的相對(duì)表達(dá)量。最終結(jié)果由PCR儀配套軟件自動(dòng)計(jì)算。OPG上游引物5＇-CCTGGGACCAAAGTGAATGC-3＇，下游引物5＇-TCTGTGGTGAGGTTCGAGTGG-3＇，產(chǎn)物197bp；RANKL上游引物5＇-CATCGGGAAGCGTACCTACAG-3＇，下游引物5＇-GCTCCCTCCTTTCATCAGGTTAT-3＇，產(chǎn)物101bp；GAPDH（內(nèi)參）上游引物5＇-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3＇，下游引物5＇-GCCCCTCCTGTTATTATGG3＇，產(chǎn)物293bp。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)強(qiáng)度的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，IL-6、TNF-α和骨代謝指標(biāo)的相關(guān)程度采用直線相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1兩組小鼠股骨BMD及各指標(biāo)的比較與CON組比較，CIH組股骨BMD、血清OC水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；而血清IL-6、TNF-α及TRACP-5b水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1　兩組小鼠股骨BMD及各指標(biāo)的比較

2.2兩組小鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CON組小鼠股骨干骺端骨小梁飽滿、連續(xù)，骨小梁間隙分布均勻；CIH組小鼠股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細(xì)，骨小梁間隙增寬，可見(jiàn)骨小梁斷裂、消失，詳見(jiàn)圖1。

圖1　兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端組織形態(tài)學(xué)觀察（A：CON組；B：CIH組；HE染色，×40）

2.3 兩組小鼠OPG、RANKL表達(dá)強(qiáng)度的比較OPG表達(dá)于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞質(zhì)和胞核；RANKL表達(dá)于軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞質(zhì)和胞核。與CON組比較，CIH組OPG表達(dá)強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而RANKL表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)圖2、3和表2、3。

圖2　兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端OPG的表達(dá)（A：CON組；B：CIH組；免疫組化，×1 000）

圖3　兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端RANKL的表達(dá)（A：CON組；B：CIH組；免疫組化，×1 000）

2.4兩組小鼠骨組織OPG、RANKL mRNA表達(dá)的比較與CON組比較，CIH組骨組織RANKL mRNA表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；OPG mRNA表達(dá)雖有下降的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而OPG/RANKL比值卻明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。

表2　兩組小鼠股骨組織OPG表達(dá)強(qiáng)度的比較

表3　兩組小鼠股骨組織RANKL表達(dá)強(qiáng)度的比較

表4　兩組小鼠骨組織OPG、RANKLmRNA表達(dá)的比較

2.5IL-6、TNF-α與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析得到的r值見(jiàn)表5。

表5　IL-6、TNF-α與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析（r值）

由表5可見(jiàn)，血清IL-6水平與BMD、血清OC水平均呈負(fù)相關(guān)，與骨組織RANKL mRNA水平呈正相關(guān)；血清TNF-α水平與BMD、血清OC水平均呈負(fù)相關(guān)，與血清TRACP-5b、RANKL mRNA水平均呈正相關(guān)。

3　討論

目前，在長(zhǎng)期低氧導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低氧加快骨吸收過(guò)程，從而加速骨量丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為骨小梁體積下降，骨小梁斷裂、稀疏。然而，CIH對(duì)骨代謝和骨質(zhì)的影響，不同的研究結(jié)果卻不盡相同[2-4]。本研究采用CIH小鼠模型，于實(shí)驗(yàn)8周末分別檢測(cè)OC和TRACP-5b水平，發(fā)現(xiàn)血清中OC水平較CON組明顯降低，而TRACP-5b水平明顯升高。OC是骨基質(zhì)的主要非膠原蛋白，由成骨細(xì)胞合成和分泌[7]，是骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)中反映成骨能力的重要指標(biāo)之一，而TRACP-5b由破骨細(xì)胞和有活力的巨噬細(xì)胞所釋放的具有特異性和高敏感度的骨吸收指標(biāo)[8-9]。OC升高，TRACP-5b降低則表示成骨能力增強(qiáng)，破骨能力降低，反之，則成骨能力降低，破骨能力增強(qiáng)。本研究中血清OC水平降低，TRACP-5b水平升高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)8周后CIH模型小鼠可能已經(jīng)存在成骨能力降低，破骨能力增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測(cè)股骨BMD和骨組織形態(tài)學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)CIH組小鼠的BMD明顯降低，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)骨小梁變稀疏、變細(xì)，骨小梁間隙增寬，骨小梁斷裂。因此，筆者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)8周后CIH小鼠已經(jīng)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的病理改變，與Conti等[2]研究結(jié)果相同?；仡櫹嚓P(guān)文獻(xiàn)，不同學(xué)者對(duì)CIH對(duì)骨質(zhì)代謝研究的結(jié)論不同，可能與其低氧暴露時(shí)間、方式和程度以及不同動(dòng)物對(duì)象有關(guān)。

維持細(xì)胞的氧穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞生命活動(dòng)的前提，組織氧濃度必須被精確地控制在特定的波動(dòng)范圍內(nèi)。正常機(jī)體的氧濃度：動(dòng)脈血約12%（95mmHg），靜脈血和毛細(xì)血管約5%（40mmHg）。當(dāng)血液氧濃度下降，導(dǎo)致細(xì)胞在低氧條件下不能產(chǎn)生足夠的APT維持細(xì)胞正常功能，就會(huì)發(fā)生病理過(guò)程。低氧相關(guān)的疾病，如高原低氧和慢性呼吸道疾病總是伴隨低骨量[1，10]。既往的研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)低氧能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和抑制成骨細(xì)胞生成和分化[11-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)CIH組骨吸收標(biāo)志物TRACP-5b水平明顯升高，結(jié)果顯示CIH對(duì)破骨細(xì)胞的影響與持續(xù)低氧是一致的，筆者認(rèn)為兩種低氧方式均能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和功能。目前有許多研究探討低氧對(duì)成骨細(xì)胞的影響。在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)低氧能刺激脂肪生成[13]，脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，因此脂肪生成增多就伴隨成骨細(xì)胞生成減少。CIH也能減少成骨細(xì)胞的增殖、減少膠原的合成以及降低堿性磷酸酶的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致骨生成減少[14]。然而，低氧對(duì)成骨細(xì)胞的影響是有爭(zhēng)議的，一些研究表明低氧促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]，減少成骨細(xì)胞硬化蛋白的表達(dá)和促進(jìn)Wnt信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)骨形成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CIH模型小鼠的血清OC水平下降，提示成骨能力下降，表明CIH抑制成骨細(xì)胞的生成和功能。

然而，CIH與高原低氧是不同的，CIH是間歇性低氧，間歇性低氧的低氧和復(fù)氧就如缺血再灌注，可以引起慢性炎癥狀態(tài)，如促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α升高[3]。炎癥細(xì)胞因子活性的變化可能對(duì)骨骼系統(tǒng)具有重要作用的觀念已得到普遍認(rèn)可。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子是最強(qiáng)的骨吸收刺激因子，它們對(duì)骨重建的調(diào)節(jié)作用基本相同，直接或間接地作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，使其分化為破骨細(xì)胞，發(fā)揮骨吸收的作用，尤其是在炎癥相關(guān)的病理性破骨細(xì)胞性骨吸收中具有重要作用。TNF-α可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和分化[17]，或間接通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞的作用而促進(jìn)骨吸收。而且，TNF-α可抑制成骨細(xì)胞合成膠原[18]。IL-6也可直接促進(jìn)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性[19]。本研究顯示升高的IL-6、TNF-α和降低的股骨BMD緊密相關(guān)，提示促炎細(xì)胞因子也參與了CIH小鼠低骨量的發(fā)生，是導(dǎo)致CIH小鼠骨量減少的重要因素。

OPG/RANK/RANKL是骨代謝和重建的重要調(diào)節(jié)因子。RANKL在骨吸收過(guò)程中扮演主要角色，RANKL異常升高將會(huì)引起破骨細(xì)胞數(shù)量增多和活性增強(qiáng)，繼而破壞骨形成和骨吸收平衡；OPG能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，從而阻礙RANKL和RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化和成熟，阻止骨吸收[20-21]。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)OPG/ RANK/RANKL調(diào)節(jié)失衡會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展。既往的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)低氧抑制小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)OPG，刺激RANKL表達(dá)，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟[22-23]，增加骨吸收信號(hào)傳遞。但本研究發(fā)現(xiàn)CIH引起骨組織RANKL表達(dá)增加，而OPG表達(dá)無(wú)明顯差異，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)血液IL-6和TNF-α水平與骨組織RANKL mRNA表達(dá)水平有明顯相關(guān)性。筆者認(rèn)為體內(nèi)研究結(jié)果與體外研究結(jié)果不相符，其原因可能為：IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子與OPG/RANK/ RANKL能相互作用有關(guān)[24-25]。

總之，CIH能導(dǎo)致骨吸收增加、骨形成下降和BMD下降，考慮與低氧以及CIH引起的IL-6、TNF-α水平升高導(dǎo)致RANKL表達(dá)升高有關(guān)。

4　參考文獻(xiàn)

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

收稿日期：（2014-06-25）

基金項(xiàng)目：溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120038）

作者單位：325015溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科（朱再勝、杜曉紅），病理科（黃卡特、鄭靖宇、戴爽、吳玲、李劍敏）

通信作者：李劍敏，E-mail：wzyxyljmin@163.com

Effects of chronic intermittent hypoxia on bone mineral density and bone metabolism in mice

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of chronic intermittent hypoxia(CIH)on bone mineral density(BMD)and bone metabolism in mice.MethodsSixteen male C57BL/6 mice aged 12 weeks were randomly assigned into 2 groups:CON group(n=8)and CIH group(n=8).Mice in CIH group were exposed to hypoxic environment 8h×6d/week,while mice in CON group were exposed to normal environment.At the end of 8 weeks all animals were sacrificed.Serum levels of OC,TRACP-5b, IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA;histopathology of bone tissue was observed by H.E staining and BMD examination was performed.The expression of OPG and RANKL protein and mRNA in bone tissue was detected by immunohistochemical staining and Real time-qPCR,respectively.ResultsHistopathology showed that in the metaphysis of distal femurs of CIH mice the bone trabecula became thinner and broken resulting in widening the intertrabecula space.Compared to CON group the BMD, serum OC level and ratio of OPG/RANKL were decreased significantly in the distal femurs of CIH group(P＜0.05 or 0.01),while the serum TRACP-5b,IL-6 and TNF-αlevel and the expression of RANKL protein and RANKL mRNA in bone were increased significantly(P＜0.05 or 0.01).But there were no significant differences in expression of OPG protein and OPG mRNA in bone between two groups(P＞0.05).The serum IL-6 and TNF-αlevels were negatively correlated with BMD(P＜0.05 or 0.01),and positively correlated with the expression of RANKL mRNA in bone tissue(P＜0.05 or 0.01).ConclusionThe results suggest that chronic intermittent hypoxia can increase bone resorption,decrease bone formation and bone mineral density,which are associated with up-regulation of IL-6 and TNF-αand higher RANKL level.

【Key words】Intermittent hypoxiaBone metabolismBone mineral densityOsteoprotegerinRANKL