血竭負(fù)載于人工真皮支架修復(fù)豬Ⅲ度燒傷對(duì)創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響

孫東杰　滕建英　徐少駿　郭健

血竭負(fù)載于人工真皮支架修復(fù)豬Ⅲ度燒傷對(duì)創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響

孫東杰滕建英徐少駿郭健

【摘要 】目的探討負(fù)載不同濃度血竭對(duì)膠原-殼聚糖人工真皮支架修復(fù)豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合及瘢痕形成、增生的影響。方法將負(fù)載4g/L和1g/L濃度血竭的真皮支架各移植于6頭豬（共12頭）Ⅲ度燒傷清創(chuàng)后創(chuàng)面（A、B組），這12頭豬另一創(chuàng)面分別植入人工真皮支架及無(wú)支架的硅膠膜作為對(duì)照（C、D組）。觀(guān)察植入支架后1、2、3、4周的創(chuàng)面修復(fù)情況，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同時(shí)間4組創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1和TGF-β3的表達(dá)。結(jié)果A組創(chuàng)面修復(fù)優(yōu)于B、C、D組。鏡下可見(jiàn)A組創(chuàng)面各時(shí)間點(diǎn)的新生血管較其他3組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A、B、C 3組的TGF-β1在2周時(shí)升高，3周時(shí)下降。D組前3周逐漸升高，4周時(shí)下降。前2周A、B、C組TGF-β1表達(dá)量高于D組，后2周則低于D組。A、B、C 3組TGF-β3表達(dá)持續(xù)升高3周，4周時(shí)回落，其中A組表達(dá)最高；D組在低水平上緩慢升高，各時(shí)間段均明顯低于A(yíng)、B、C 3組表達(dá)量。結(jié)論負(fù)載高濃度血竭能明顯提高膠原-殼聚糖人工真皮支架修復(fù)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面時(shí)的血管化速度，促進(jìn)創(chuàng)面更快愈合的同時(shí)可有效抑制瘢痕增生。

【關(guān)鍵詞】血竭人工真皮支架Ⅲ度燒傷TGF-β瘢痕

血竭是一種傳統(tǒng)中藥，由棕櫚科植物麒麟竭果實(shí)中滲出的樹(shù)脂加工制成，在我國(guó)有1 500多年使用歷史，具有活血化瘀、祛腐生肌、止血收斂、消腫止痛等作用，主治外傷性疾病。本研究采用膠原-殼聚糖人工真皮支架負(fù)載不同濃度血竭修復(fù)豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，觀(guān)察真皮支架的血管化，進(jìn)而探討其對(duì)創(chuàng)面愈合及瘢痕形成、增生的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康廣西巴馬小香豬（許可證號(hào)：SYXK＜滬＞2004-0004）12只，雌性，體重8.2～11.7（9.8±1.2）kg。

1.1.2其他材料牛Ⅰ型膠原與殼聚糖 [分子量Mr：（1.0～1.7）×105，75%～85%脫乙酰度]由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。醫(yī)用級(jí)硅橡膠薄膜由上海鑫誠(chéng)公司提供。聚丙烯移植環(huán)（外徑3.3cm，內(nèi)徑3.1cm，高0.4～1.0cm）由浙江玉升醫(yī)療器械公司提供。龍血竭膠囊（z53020999）由云南云河藥業(yè)有限公司提供。TGF-β1單克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供。TGF-β3多克隆抗體產(chǎn)自美國(guó)Santa Cruz公司。SP免疫組化檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Zymed公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Ⅲ度燒傷創(chuàng)面模型制作采用3%戊巴比妥腹腔注射和速眠新Ⅱ肌肉注射復(fù)合麻醉。將直徑2.5cm的圓柱形銅塊在100℃水浴箱中升溫至（99.0±0.5）℃以上，在豬背部?jī)蓚?cè)距離后正中線(xiàn)3～4cm處恒溫恒壓持續(xù)70s造成Ⅲ度燒傷[1]。常規(guī)清創(chuàng)后聚維酮碘包扎，換藥1次/d。

1.2.2負(fù)載血竭的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架制備將制備的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層真皮支架（真皮支架的孔隙率＞90%，平均孔徑80～200μm，厚度2mm，直徑3.1cm，醫(yī)用級(jí)硅橡膠薄膜與制備的真皮支架粘合形成雙層支架）放置在超凈工作臺(tái)中以紫外線(xiàn)燈照射過(guò)夜，滅菌后備用[2]。將龍血竭粉按比例溶于75%乙醇中，配制成1g/L和4g/L兩種濃度的乙醇溶液，4g/L為其飽和濃度。在超凈臺(tái)中將不同濃度的血竭乙醇溶液分別滴加在支架材料上，每個(gè)材料加500μl，4%冰箱保存，使用前用0.9%氯化鈉溶液浸洗5min×3次除去乙醇。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組在每只豬背部制作2處Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，共24處，創(chuàng)面切痂后移植真皮支架。隨機(jī)選擇其中6只豬，2處創(chuàng)面分別植入負(fù)載高濃度血竭（4g/L）的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架和單純膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架。剩余6只豬的2處創(chuàng)面分別植入負(fù)載低濃度血竭（1g/L）的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架和無(wú)支架的硅橡膠膜。負(fù)載高、低濃度血竭人工真皮支架各6處分別設(shè)為A組和B組；未負(fù)載血竭人工真皮支架和無(wú)支架的硅橡膠膜各6處作為對(duì)照，分別設(shè)為C組和D組。

1.2.4Ⅲ度燒傷創(chuàng)面切痂后雙層人工真皮支架植入[1]燒傷48h后，同上法麻醉后行Ⅲ度燒傷創(chuàng)面切痂，切痂至有出血的正常組織（脂肪或肌肉），切痂直徑3.05～3.15（3.10±0.03）cm。A、B、C組：將不同人工真皮支架修剪至與移植環(huán)內(nèi)徑一致，硅膠膜面朝上放入制備好的創(chuàng)面上，使創(chuàng)面與真皮支架貼合。D組：直接在創(chuàng)面上覆蓋硅橡膠膜。

1.2.5創(chuàng)面觀(guān)察及取材在真皮支架植入后1、2、3周時(shí)打開(kāi)內(nèi)層敷料，進(jìn)行創(chuàng)面大體觀(guān)察，并在創(chuàng)面中間切取1.0cm×0.5cm深至肌層的組織塊。每處組織標(biāo)本切片，一部分進(jìn)行HE染色，于400倍的光鏡下作組織學(xué)觀(guān)察，隨機(jī)觀(guān)察10個(gè)視野，對(duì)毛細(xì)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.6創(chuàng)面表皮移植[1]支架植入2周時(shí)取厚約1mm豬刃厚皮，剪成（0.5～0.7）cm×（0.5～0.7）cm大小組織塊，置0.2%胰酶磷酸緩沖液中37℃消化100min，將表皮從真皮上分離。打開(kāi)創(chuàng)面，揭下硅橡膠膜，植入分離的表皮（0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色表明表皮細(xì)胞成活率在80%以上），打包加壓固定。支架植入術(shù)后4周打開(kāi)植皮區(qū)觀(guān)察表皮成活情況并取材，以成活表皮所占比例表示成活率。組織學(xué)觀(guān)察方法同前3周標(biāo)本。

1.2.7創(chuàng)面組織TGF-β1、TGF-β3表達(dá)的檢測(cè)于真皮支架植入后1、2、3、4周取各處組織切片行TGF-β1、TGF-β3表達(dá)的檢測(cè)。采用免疫組化SP法，TGF-β1和TGF-β3一抗?jié)舛葹?∶200，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)，DAB顯色，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色，主要表達(dá)于血管和成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中。于400倍光鏡下隨機(jī)觀(guān)察10個(gè)視野的陽(yáng)性信號(hào)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1創(chuàng)面大體觀(guān)察A、B、C 3組不同的真皮支架移植后1～3周創(chuàng)面色澤均逐漸由白色變成紅色，但A組較其他兩組更為紅潤(rùn)，創(chuàng)面支架與組織的整合也更好，而其他組仍存在不同程度蒼白組織（圖1-4，見(jiàn)插頁(yè)）。4周時(shí)，A組和 B組的表皮成活率分別為 100%和（87.5±6.5）%，C組為（65.0±2.4）%；D組1～2周時(shí)創(chuàng)面分泌物較多，3周時(shí)創(chuàng)面粗糙，4周時(shí)表皮成活率為（48.0±5.5）%。

2.2創(chuàng)面組織學(xué)觀(guān)察見(jiàn)表1和圖5、6（見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 A組術(shù)后3周時(shí)創(chuàng)面情況　

圖2　B組術(shù)后3周時(shí)創(chuàng)面情況

圖3　C組術(shù)后3周時(shí)創(chuàng)面情況　

圖4　D組術(shù)后3周時(shí)創(chuàng)面情況

圖5　A組術(shù)后3周創(chuàng)面組織學(xué)觀(guān)察，箭頭所示為毛細(xì)血管（HE，× 400）

圖6　B組術(shù)后3周創(chuàng)面組織學(xué)觀(guān)察（HE，×400）

圖7　A組術(shù)后3周時(shí)TGF-β1表達(dá)情況（免疫組化，×400）

由表1可見(jiàn)，A組創(chuàng)面各時(shí)間點(diǎn)新生血管數(shù)均明顯多于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），D組在1、2周時(shí)新生血管數(shù)無(wú)明顯增多，3、4周時(shí)新血管數(shù)有所增多。

表1　4組創(chuàng)面各時(shí)間點(diǎn)新生毛細(xì)血管計(jì)數(shù)（個(gè)）

由圖5、6可見(jiàn)，3周時(shí)A組創(chuàng)面真皮組織毛細(xì)血管密度明顯高于B組。

2.34組創(chuàng)面組織各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、TGF-β3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)的比較 見(jiàn)表2、圖7-10（見(jiàn)插頁(yè)）。

圖8　B組術(shù)后3周時(shí)TGF-β1表達(dá)情況（免疫組化，×400）

圖9　A組術(shù)后3周時(shí)TGF-β3表達(dá)情況（免疫組化，×400）

圖10　B組術(shù)后3周時(shí)TGF-β3表達(dá)情況（免疫組化，×400）

表2　4組創(chuàng)面組織各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、TGF-β3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)）

由表2可見(jiàn)，A、B、C 3組TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)2周時(shí)最高，3周時(shí)較2周時(shí)降低，4周最低；D組前3周表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加，3周時(shí)達(dá)到最高，4周時(shí)降低，但仍高于2周時(shí)。同組前后時(shí)間點(diǎn)兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4組前3周時(shí)TGF-β3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均逐漸增加；A、B、C 3組4周時(shí)陽(yáng)性表達(dá)低于前3周，D組4周時(shí)陽(yáng)性表達(dá)則高于3周時(shí)。同組前后時(shí)間點(diǎn)兩兩相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。各組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為A組最多，D組最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

血竭能抗血小板集聚，增高纖維蛋白溶解酶活性單位，促進(jìn)纖溶活性[3]。中醫(yī)用其治療燒傷可改善創(chuàng)面瘀滯區(qū)微循環(huán)，避免大量微血栓形成，顯著提高微循環(huán)血量，阻止瘀滯區(qū)組織發(fā)生凝固性壞死。本實(shí)驗(yàn)是將血竭溶液負(fù)載于人工真皮支架，再經(jīng)支架移植及表皮移植來(lái)進(jìn)行治療。通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面觀(guān)察以及組織學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，負(fù)載高濃度血竭的人工真皮支架內(nèi)血管生成明顯較多較快，3周已基本完全血管化。Ⅲ度燒傷由于全層皮膚壞死需通過(guò)自體皮膚移植修復(fù)，愈合效果則取決于所植皮片能否得到基底的充足血供，因而人工真皮支架的血管化速度也決定了創(chuàng)面的愈合速度。實(shí)驗(yàn)4周后，高濃度血竭組的表皮成活率達(dá)到100%證明了血竭對(duì)人工真皮支架血管化的促進(jìn)作用。

深度創(chuàng)面愈合往往伴隨瘢痕增生現(xiàn)象，是由多種細(xì)胞和生物活性物質(zhì)聚集并產(chǎn)生復(fù)雜生物反應(yīng)所致。TGF-β是目前公認(rèn)的瘢痕生長(zhǎng)相關(guān)因子，其中TGF-β1是已知的與創(chuàng)面修復(fù)和瘢痕增生關(guān)系最為密切、最具代表性的細(xì)胞因子[4]，其與瘢痕增生呈正相關(guān)，可能通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞的大量增生并使其活性增強(qiáng)，促進(jìn)膠原蛋白的合成而導(dǎo)致組織增生、瘢痕形成[5]。因此創(chuàng)面早期TGF-β1高表達(dá)有利于創(chuàng)面盡快修復(fù)，但持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間高表達(dá)則促使瘢痕過(guò)度增生[6]。TGF-β3在胎兒的皮膚無(wú)瘢痕再生過(guò)程中有較高表達(dá)，雖然TGF-β3也能刺激成纖維細(xì)胞增生并使其活性增強(qiáng)，促進(jìn)膠原蛋白的合成，但卻并不刺激瘢痕的形成[7]。研究表明TGF-β3是TGF-β1的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗物[8]，因此創(chuàng)面TGF-β3的高表達(dá)有利于抑制瘢痕增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種支架在創(chuàng)面愈合早期與無(wú)支架組相比TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)均明顯增加，2周達(dá)高峰，以高濃度血竭組為最高。此后急劇減少，在3、4周已明顯低于無(wú)支架組。而3種支架組表達(dá)TGF-β3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在1～3周大幅升高，4周雖然有所回落，仍遠(yuǎn)高于無(wú)支架組，其中負(fù)載高濃度血竭支架組的TGF-β3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于負(fù)載低濃度血竭支架組和未負(fù)載血竭支架組。從兩種細(xì)胞因子的表達(dá)情況可以看到，人工真皮支架修復(fù)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面既可促進(jìn)愈合又有利于抑制瘢痕增生，高濃度血竭通過(guò)促進(jìn)人工真皮支架血管化可強(qiáng)化這種效果。而負(fù)載血竭濃度較低時(shí)，強(qiáng)化作用不明顯。

綜上所述，膠原-殼聚糖人工真皮支架負(fù)載高濃度血竭修復(fù)豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，借助血竭的促血管化作用，可在早期更為迅速地修復(fù)創(chuàng)面，同時(shí)在遠(yuǎn)期亦可有效抑制創(chuàng)面瘢痕增生。

4　參考文獻(xiàn)

[1]滕建英,郭瑞,謝菁,等.移植不同人工真皮支架對(duì)豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面血管化及瘢痕形成的影響[J].中華燒傷雜志,2012,28(1):13-18.

[2]徐少駿,黃愛(ài)賓,馬列,等.膠原-殼聚糖真皮支架原位誘導(dǎo)修復(fù)豬全層皮膚缺損研究[J].中華外科雜志,2009,47(4):305-308.

[3]付梅紅,方婧,王祝舉,等.血竭藥理研究與臨床應(yīng)用概述[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(6):1498-1500.

[4]Liu W,Wang D R,Cao Y L.TGF-β:a fibrotic factor in wound scarring and a potential target for anti-scarring gene therapy[J]. Curr Gene Ther,2004,4(1):123-136.

[5]王文婷,單菲,王曉川,等.TGF-β1對(duì)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào),2011,49(7):19-23.

[6]Pellard S.Epidemology,aetiology and management of abnormal scarring:a review of literature[J].J Wound Care,2006,15(1):44-48

[7]唐世杰,朱鎮(zhèn)森,胡素鑾,等.TGF-β3基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華損傷與修復(fù)雜志,2010,5 (1):26-33.

[8]Cambell B H,Agarwal C,Wang J H,et al.TGF-beta1,TGF-beta3,and PEG(2)regulate contraction of human patellar tendon fiabroblasts[J].Biomech Model Mechanobiol,2004,2(4):239.

（本文編輯：楊麗）

收稿日期：（2014-08-08）

基金項(xiàng)目：浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金（2011ZB124）

作者單位：310015杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院（孫東杰），杭州師范大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（滕建英）；杭州瑞麗整形外科（徐少駿）；浙江省中醫(yī)院（郭?。?/p>

通信作者：滕建英，E-mail：tengjianying5@yahoo.com.cn

Application of Sanguis draconis-coated artificial dermal stent in treatment of full-thickness burn wound of pigs

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the efficacy of Chinese traditional medicine Sanguis draconis-coated collagen-chitosan artificial dermal stent in treatment of full-thickness burn wound in pigs.MethodsFull thickness burn wounds were induced in 12 Bama miniature pigs.After debridement,collagen-chitosan artificial dermal stents coated with Sanguis draconis 4g/L (group A),1g/L(group B),or artificial dermal stents without coating were implanted on wounds(group C);the wounds without stents implantation served as controls(group D).The wound repairing and pathological changes were observed 1,2,3 and 4 weeks after treatment;the TGF-β1 and TGF-β3 expressions in wounds were detected by immunohistochemical staining.ResultsThe wounds repairing and new micro-vessel growth in group A were better than those in other groups.Expression of TGF-β1 was increased in the wounds of groups A，B and C in the first 2 weeks，decreased at week 3;for group D it increased in the first 3 weeks and decreased at week 4.The expression of TGF-β1 of group A，B，C were higher in first 2 weeks and lower in last 2 weeks than that of group D.Expression of TGF-β3 was increased in groups A,B and C in the first 3 weeks and decreased at week 4 week;compared to group B and C TGF-β3 expression in group A was the highest.TGF-β3 expression in group D was lower than 3 groups at all time points.ConclusionChinese traditional medicine Sanguis draconis-coated collagen-chitosan artificial dermal stent can promote angiogenesis in tissue,improve wound healing and inhibit the hyperplasia of scar in treatment of full-thickness burn injury in pigs.

【Key words】Dragon's bloodArtificial dermal stentFull thickness burn woundTGF-βScar