肝素酶B細胞表位MAP疫苗對肝癌生長及肺轉移影響的實驗研究

張駿　楊建民　王慧菊　崔盈　陶厚權　茹國慶　趙仲生　潘盈盈

肝素酶B細胞表位MAP疫苗對肝癌生長及肺轉移影響的實驗研究

張駿楊建民王慧菊崔盈陶厚權茹國慶趙仲生潘盈盈

【摘要】目的研究自行合成的肝素酶B細胞表位多抗原肽（MAP）疫苗在活體內對HCC97H原發(fā)性肝癌生長及肺轉移的抑制作用。方法新鮮合成肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗并經主動免疫白毛黑眼兔獲得特異性免疫血清，經純化后被動免疫于荷瘤鼠體內，觀察肝癌局部生長侵襲情況及肺部微轉移灶數(shù)目、肝癌組織中VEGF、bFGF、CD34的表達等情況，并進行統(tǒng)計分析。結果通過主動免疫的方法，獲得了含高濃度、高純度且能與肝素酶50kDa大亞基及前體蛋白特異性結合的抗MAP抗體的免疫血清，該特異性抗體可顯著抑制HCC97H細胞肝素酶活性、抑制VEGF和bFGF的表達及降低微血管密度；注射抗肝素酶B細胞表位MAP抗體各組的原位肝癌體積及肺轉移灶數(shù)目都明顯小于未經免疫兔IgG對照組（P＜0.01）及希羅達陽性對照組（P＜0.05），且其作用具有一定的濃度依賴性。結論本研究證實了肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗在活體內具有抗原發(fā)性肝癌生長及抑制肺轉移的作用，可為原發(fā)性肝癌的防治提供新的思路。

【關鍵詞】肝素酶B細胞表位原發(fā)性肝癌疫苗

原發(fā)性肝癌是目前全世界發(fā)病率和病死率最高的致死性惡性腫瘤之一[1]。近年來表位肽疫苗作為肝癌的補充防治手段研究較為熱門，但由于其分子量較小且結構單一，容易造成免疫原性降低，在體內往往不能誘發(fā)理想的體液免疫反應。近年來提出的多抗原肽（multiple antigenic polypeptide，MAP）設計方案，采用賴氨酸為核心基質，將若干條抗原表位單體肽偶聯(lián)在一起，形成樹枝狀結構，能極大的提高肽類疫苗的免疫效能[2]。我們在前期關于表位肽疫苗的研究工作中，采用8分枝肽偶聯(lián)的MAP方案，已成功設計出肝素酶B細胞表位MAP疫苗[3]。本研究擬在此基礎上，用主動免疫序貫以被動免疫的方法，觀察該MAP疫苗在活體內抗人肝癌原位生長及侵襲轉移效應，并探討可能的作用機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物與主要試劑4～5周齡BALB/c裸鼠，雌性，體重18～25g（購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，證書號：SCXK20130115）。雄性6月齡白毛黑眼兔購自浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。人原發(fā)性肝癌HCC97H細胞株由第三軍醫(yī)大學楊仕明教授惠贈，為貼壁生長型高轉移潛能肝癌細胞株。商品化兔抗人全長肝素酶全蛋白抗體（購自以色列InSight公司）。肝素酶標準品和肝素酶活性測定試劑盒（均購自日本Takara Bio公司）。

1.2合成MAP疫苗及主動免疫試驗主動免疫1周前根據(jù)前期研究中確定的肝素酶B細胞表位序列（圖1A），委托杭州中肽生化有限公司按既定的8分枝肽方案新鮮合成肝素酶B細胞表位MAP疫苗（圖1B），-80°C保存，具體方法參照我們既往的研究報道[3]。

圖1　A:肝素酶大亞基序列（灰色背景）及B細胞表位（紅色肽段）B:肝素酶B細胞表位多抗原肽（MAP）疫苗結構示意圖

用該自行合成的疫苗主動免疫白毛黑眼兔，每2周1次，共4次。首次及加強免疫量為1mg疫苗混入等量的Th線性短肽，溶于0.5ml的PBS中，與0.5ml弗氏佐劑乳化后，在背部皮內作多點注射。首次免疫前及每次免疫后10d采血，共采血5次，標準間接ELISA法動態(tài)測定兔血清中所含特異性多克隆抗體的滴度；最后用辛酸/硫酸銨鹽析法（CA-AS法，是一種經典的IgG純化方法[4]）純化抗血清及陰性對照血清，用考馬斯亮藍測定所得抗體（IgG）的濃度。

1.3Western-blot間接分析提純到的抗體的特異性HCC97H細胞（3×107個）裂解后提取總蛋白，用免疫印跡間接鑒定所得到的經純化抗體的特異性及與肝素酶可能的結合位點；所用抗體為商品化的抗肝素酶全蛋白抗體或所純化的抗肝素酶B細胞表位MAP抗體，而經CA-AS法純化的未經免疫兔血清的IgG作為陰性對照；免疫熒光觀察所得條帶，與商品化全蛋白抗體所得條帶的kDa數(shù)值作比。

1.4HCC97H細胞肝素酶活性抑制試驗體外觀察該特異性抗體對HCC97H細胞肝素酶活性的抑制作用。于24孔板中接種密度為5×104個/孔HCC97H細胞，培養(yǎng)48h。加入終濃度分別為0μg/ml（Control組）、10μg/ml（C1組）、50μg/ml（C2組）、100μg/ml（C3組）的抗肝素酶B細胞表位MAP多克隆抗體及100μg/ml正常兔IgG（PIS組）共同培養(yǎng)1h。取培養(yǎng)基上清液，通過檢測450nm吸光度來測定殘存的未被肝素酶降解的乙酰肝素含量，從而反映HCC97H細胞肝素酶活性抑制率。

1.5原位荷瘤鼠模型的建立取處于對數(shù)生長期HCC97H細胞（1×107個）皮下注射種植于BALB/c裸鼠右前腋下。待皮下種植瘤生長至1cm3左右，完整取出皮下種植瘤，剔除壞死組織及結締組織后，修剪成2mm3大小的瘤塊待用。60只裸鼠先后經異氟烷麻醉后，接AWS大小動物麻醉呼吸機，取仰臥位，0.5%碘伏消毒手術野皮膚后于左肋緣下作一長約1.5cm斜切口，全層切開腹壁進腹。輕輕拖出肝左葉，在其上作一長約0.3cm斜切口，往切口內種植2塊2 mm3大小的瘤塊并壓迫數(shù)十秒，待血凝固后小心將肝左葉放回腹腔內，逐層關腹。

1.6被動免疫及觀察60只裸鼠用隨機區(qū)組法分為6組：組1：低濃度（2mg/kg）抗體一次性（造模后第2周）給藥；組2：高濃度（4mg/kg）抗體一次性給藥；組3：低濃度抗體多次（造模后第2、4周）給藥；組4：高濃度抗體多次給藥；組5：希羅達陽性對照組（卡培他濱20mg/kg的劑量每日灌胃給藥，持續(xù)4周）；組6：陰性對照組（未經免疫的并經CA-AS法純化的白毛黑眼兔IgG尾靜脈給藥）。造模后第4周用動物體外B超對各組原位移植瘤大小進行檢查（公式v=ab2/2，其中a為瘤體最大徑，b為垂直于最大徑的瘤直徑），以確保給藥前各組瘤負荷的一致性。然后用所得特異性抗體對荷瘤裸鼠模型尾靜脈給藥，觀察8周。8周后處死裸鼠，剜出肝臟原位腫瘤，用游標卡尺檢測并依據(jù)上述公式v=ab2/2計算原位腫瘤體積。切除所有肺組織，甲醛溶液固定，石蠟包埋。雙肺蠟塊取5個冠狀切面，每個切面連續(xù)切片5張，每張切片厚約4～5μm，每個切面相距0.8mm（以最大冠狀切面為中心），HE染色后在鏡下計數(shù)并比較各組肺轉移灶平均數(shù)。

1.7肝癌組織微血管密度（micro vessel density，MVD）檢測用SP法免疫組化半定量檢測肝癌組織中CD34（最常用的MVD染色標記之一[5]）的表達。原位種植肝癌組織經甲醛固定、石蠟包埋、4μm連續(xù)切片。所用一抗為鼠抗人CD34單克隆抗體，用已知陽性切片同時在同一條件下染色作為陽性對照，用pH7.4的PBS代替一抗作為陰性對照。CD34染色結果參照Weidner等[5]的研究并由我院病理科2位高年資病理醫(yī)生（副主任醫(yī)師及以上）采用盲法作出判斷，具體標準如下：（1）陽性標準為血管內皮細胞形成的條狀或隙狀等孤立及簇狀結構呈現(xiàn)出明顯的棕黃染色并伴有管腔；（2）管腔＜10個紅細胞大小的均計為1條血管,相互分離的內皮細胞按1條血管計數(shù)，血管腔＞10個紅細胞或關閉可見平滑肌者不計入內；（3）先在低倍鏡（×100）下確定3個血管著色最密集區(qū)域即“熱點”，然后在高倍鏡（×200）下計數(shù)微血管，并記錄；（4）同一張切片取3個高倍鏡視野的微血管數(shù)值的均值作為MVD，比較各組間MVD的大小。

1.8免疫組化染色檢測VEGF及bFGF的表達原位種植肝癌組織經甲醛固定、石蠟包埋、4μm連續(xù)切片。免疫組化所用一抗為兔抗人VEGF/bFGF單克隆抗體，染色結果判定參照Shimizu等[6]的研究：（1）首先采用低倍鏡觀察，選取陽性細胞密集的所謂“熱點”區(qū)，胞質或胞膜染為淡黃色至棕褐色為陽性細胞標志；（2）在100倍視野下記數(shù)5個視野中的500個癌細胞，并計算陽性細胞占腫瘤細胞的百分率，按陽性細胞率計分：陰性為0分，陽性細胞率≤10為1分，11～50為2分，≥51為3分；（3）按癌細胞免疫組化染色深淺計分：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（4）最后計算染色強度與陽性細胞率的乘積，并用（-）號或者（+）號來表示VEGF或bFGF免疫組化染色結果：0～2分為（-），3～4分為（+），5～7分為（++），8～9分為（+++）。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)之間的比較采用one-way ANOVA檢驗。

2　結果

2.1MAP疫苗的合成及主動免疫試驗合成肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗后對其進行HPLC純度分析，經積分運算計算主峰，測得其主峰面積百分數(shù)達到95%以上，提示已合成了高純度的MAP疫苗。用MAP疫苗主動免疫白毛黑眼兔后10d，兔血清中即可檢出特異性抗MAP多肽的抗體；在第50天，血清中抗體滴度達到最高值1∶140 000（圖2）；而陰性對照中特異性抗體滴度始終為0?？寡褰浄蛛x、CA-AS法純化后，用考馬斯亮藍測得其特異性抗體濃度為15.2 mg/ml，而陰性對照組中IgG總濃度僅為0.16mg/ml。

圖2　免疫血清抗體滴度動態(tài)檢測圖

2.2抗血清中抗體特異性檢測Western-blot結果如圖3所示，商品化全蛋白肝素酶抗體組在65kDa附近可見一清晰條帶，在50kDa附近可見一非常清晰的條帶；而在抗MAP抗血清組，2條非常清晰的條帶顯示于65kDa及50kDa附近；根據(jù)商品化肝素酶抗體的產品說明，65kDa處的蛋白為肝素酶前體蛋白，50kDa附近蛋白為肝素酶大亞基，即肝素酶活性基團；而在陰性對照組，相應位置未見明顯條帶顯示。

圖3　Western-blot間接檢驗所得抗體的特異性（1：商品化全蛋白肝素酶抗體組；2：抗MAP抗血清組；3：陰性對照組）

2.3肝素酶MAP抗體對HCC97H細胞肝素酶活性的抑制作用與Control組比較：C3組的HCC97H細胞肝素酶活性下降了51.0%（P＜0.01）；C2組HCC97H肝癌細胞的肝素酶活性下降了15.8%（P＜0.05）；而C1組及PIS組HCC97H細胞的肝素酶活性未見明顯下降（P＞0.05）（圖4）。

2.4裸鼠原位肝癌肺轉移模型的建立肝臟原位種植術后第4周對各組裸鼠模型用體外B超水囊法檢測肝臟原位腫瘤的大小，結果顯示各組原位腫瘤大小均一性較好，組1～6腫瘤體積分別為：（46.8±6.5）、（45.9±6.9）、（46.9±4.4）、（44.9±5.1）、（46.2±5.9）、（45.4±5.8）mm3；被動免疫前各組間瘤塊體積均值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4　肝素酶MAP抗體對HCC97H細胞肝素酶活性的抑制作用（*P＜0.05,**P＜0.01）

2.5被動免疫及觀察至實驗結束，組1～6存活的荷瘤裸鼠數(shù)量分別為10、10、9、10、10、9只。處死所有裸鼠并完整剜出腫瘤，測得組1～6裸鼠肝臟原位腫瘤的體積分別為：（2 214±584）、（1 277±493）、（2 270±515）、（1 175±591）、（3 188±366）、（4 535±893）mm3；組1、組2、組3及組4的腫瘤體積明顯小于第6組（均P＜0.01）及第5組（P＜0.05）；第5組腫瘤體積也明顯小于第6組（P=0.0273）；組1與組2之間（P=0.0409），以及組3與組4之間（P=0.0315）腫瘤體積的差異也具有統(tǒng)計學意義；但組1與組3之間（P=0.8903），組2與組4之間（P= 0.7999）腫瘤體積差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

肺組織HE染色鏡檢可見肺轉移性癌灶，轉移灶多分布于周邊肺，以間質及實質內微轉移瘤為主，部分可見血管內瘤栓，微轉移灶多由數(shù)十個癌細胞組成，灶內腫瘤細胞體積增大，核大濃染、失去極性、胞質較少（圖5）；組1～6的平均肺微轉移灶數(shù)量分別為 （6.7±4.1）、（3.2±2.3）、（5.8±3.3）、（2.5±1.9）、（11.3±4.7）、（13.9±6.2）個；與組6或組5相比較，組1～4的肺轉移灶數(shù)目明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），并且組1與組2（P=0.0311）、組3與組4（P=0.0172）肺轉移灶數(shù)量也均有統(tǒng)計學差異；然而，組1與組3之間（P=0.6028）、組2與組4之間（P=0.4731），以及組5與組6之間（P= 0.3166）肺轉移灶數(shù)目無統(tǒng)計學差異（圖6）。

2.6肝癌組織MVD比較免疫組化染色結果顯示，CD34呈環(huán)片狀、成簇不規(guī)則分布為主，微血管區(qū)與無血管區(qū)間或存在（圖7）；計數(shù)結果顯示，組1～6的平均微血管數(shù)分別為：（17.7±2.5）、（11.3±3.2）、（16.7±2.3）、（9.7±3.2）、（29.1±5.6）、（32.0±3.5）條；其中，與組6或組5相比較，組1～4的MVD數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且組1與組2（P=0.0458）、組3與組4（P=0.0375）MVD數(shù)也具有統(tǒng)計學差異；然而組1與組3之間（P=0.6388）、組2與組4之間（P=0.5599），以及組5與組6之間（P=0.4725）MVD數(shù)值無統(tǒng)計學差異。

圖5　HCC97H肝癌肺微轉移灶（a:肺實質內單發(fā)微轉移灶；b:肺邊緣微轉移灶；c:肺實質內偶聯(lián)多發(fā)微轉移灶；d:血管內瘤栓；HE染色；×200）

圖6　各組肺轉移灶數(shù)目比較

2.7肝癌組織VEGF及bFGF的表達組1～組6的VEGF免疫組化染色強弱分別為：++、+、++、+、+++、+++；而組1～組6的bFGF免疫組化染色強弱分別為：++、+、++、+、+++、+++。各組具有代表性的VEGF及bFGF免疫組化染色照片分別如圖8-9所示。

圖7　CD34免疫組化染色圖（圖中1～6分別為組1～組6；×400）

圖8　肝癌組織VEGF免疫組化染色照片（圖中1～6分別為組1～組6；×400）

圖9　肝癌組織bFGF免疫組化染色照片（圖中1～6分別為組1～組6；×400）

3　討論

肝素酶是近年來研究較熱的腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA），其普遍高表達于高侵襲、轉移潛能的腫瘤細胞株中，在哺乳動物的淋巴器官、胎盤及血小板中少量表達，而在其他正常組織器官中不表達或呈極低水平表達[7]。在所有的糖苷類內切酶中，肝素酶是唯一能破壞作為阻止腫瘤侵襲和轉移重要屏障的細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）的必需酶。業(yè)已證實，肝素酶在黑色素瘤、胃癌、結腸癌、肝癌、乳腺癌及卵巢癌等實體瘤的生長、侵襲、轉移等惡性進程中起著重要的作用[8]。

新近國內外的研究發(fā)現(xiàn)，肝素酶的抑制劑及抗肝素酶的反義核酸、核酶和小片段干擾RNA已被證實具有明顯的抗腫瘤生長及轉移的作用，針對肝素酶50kDa大亞基的抗體能顯著降低肝素酶的活性,多位學者更是預言，肝素酶活性的抑制類制劑有望開發(fā)成為一類抗腫瘤的重要藥物[9-12]。然而，目前國內外研究所有的肝素酶抑制劑，包括反義核酸、核酶、小片段干擾RNA及抗肝素酶50kDa大亞基抗體等都存在異源性、易降解、時效短、實際治療可操作性差等缺點[11]，因此，若能通過肝素酶B細胞表位多抗原肽疫苗在活體內誘生出天然的特異性多克隆抗體來防治腫瘤的生長及轉移，勢必可為原發(fā)性肝癌免疫治療領域的研究帶來巨大的突破，并具有良好的應用前景。

我們在先前基于肝素酶的研究中，發(fā)現(xiàn)人肝素酶大亞基第279～293片段是優(yōu)勢B細胞表位，繼而據(jù)此設計、合成了人肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗，并發(fā)現(xiàn)該MAP疫苗抗體在體外能有效抑制HCCLM6細胞的侵襲性[3]。迄今，尚未有關于肝素酶B細胞表位MAP疫苗體內抗原發(fā)性肝癌生長及轉移的研究見諸報道。在本研究中，我們先通過主動免疫的方式，用肝素酶MAP疫苗主動免疫白毛黑眼兔，經ELISA法、考馬斯亮藍法檢測，我們獲得了含極高滴度（1∶140 000）、極高濃度（15.2 mg/ml）的抗MAP抗體的抗血清，而陰性對照血清中抗MAP抗體滴度始終為0，其血清中抗體濃度僅為0.16 mg/ml；由于白毛黑眼兔具有天然的補體、抗體水平低下等特點[13]，本研究所測得的抗體濃度基本上可代表該抗血清中抗MAP抗體的濃度水平。

國外學者Levy-Adam等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，肝素酶B細胞表位抗體可與肝素酶蛋白50kDa大亞基特異性的結合。在本研究中，我們用Western-blot試驗進一步驗證了所得抗血清中的特異性抗體是否可與HCC97H細胞肝素酶蛋白相結合及其可能的結合位點，結果提示經主動免疫WHBY兔所得的肝素酶特異性抗體不僅可與HCC97H細胞肝素酶大亞基相結合，還可與其前體蛋白的優(yōu)勢表位特異性結合。Levy-Adam等[14]亦發(fā)現(xiàn)，由肝素酶大亞基N端的B淋巴細胞優(yōu)勢表位所誘生的抗體可有效降低肝素酶的活性。而在本研究中，我們所用的B細胞表位源自肝素酶大亞基肽鏈氨基酸序列的第279～293位，并非源自50kDa大亞基的N端，且該B細胞表位肽所誘生的抗肝素酶MAP抗體也可有效降低HCC97H細胞肝素酶的活性。我們的試驗結果表明，產生具有生物學封閉作用抗體的肝素酶B細胞表位可能并非是唯一的。但究竟哪個表位所對應的抗體對肝素酶活性的抑制作用最強還有待進一步的深入研究。

由于裸鼠屬基因工程免疫缺陷鼠，對移植物無排異反應，因而理論上可以接受采用異種血清進行被動免疫試驗。而事實上，早在1981年，研究人員就已經證實了向基因工程鼠體內注射不超過0.2ml的異種血清的實驗方法具有足夠高的可行性及安全性[15]。為了排除該抗MAP抗血清中混雜的少量非特異性抗體及補體等物質對原發(fā)性肝癌體內惡性進程的影響，我們特在研究中用未經免疫、經CA-AS法初步純化的兔血清作為陰性對照。結果顯示，抗MAP抗體治療組的裸鼠肝癌肺轉移灶數(shù)目顯著少于陰性對照組及陽性對照組；高濃度（4mg/kg）給藥組的肺轉移灶數(shù)目也顯著少于相應的低濃度量（2mg/kg）給藥組；然而，從給藥頻率來看，多次給藥相對于單次給藥并不能明顯的減少肺轉移灶數(shù)目。研究表明，肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗能夠在活體內產生抗MAP特異性抗體，進而通過該抗體發(fā)揮抑制原發(fā)性肝癌肺轉移的作用，且其作用效果呈一定的濃度依賴性。

血管生成細胞因子VEGF、bFGF與原發(fā)性肝癌的生長、轉移及預后密切相關[16]，而肝素酶能夠降解HSPG的HS鏈，釋放、激活結合在HS鏈兩端的血管生成相關的VEGF及bFGF等細胞因子，進而影響內皮細胞的增殖和血管生成。在本研究中，我們通過計算免疫組化陽性染色細胞百分比來半定量比較各組肝癌組織VEGF和bFGF蛋白的表達，結果表明，治療組VEGF/bFGF在肝癌組織的表達及血清濃度都顯著低于陰性對照組及希羅達陽性對照組；且高濃度（4mg/kg）給藥組VEGF/ bFGF在肝癌組織的表達及血清中的濃度低于相應的低濃度（2mg/kg）給藥組；然而，從給藥頻率來看，多次給藥相對于單次給藥并不能明顯的降低VEGF/bFGF在肝癌組織中的表達及血清中的濃度。MVD被認為是衡量血管生成的金標準，而CD34是最常用的MVD免疫組化染色標記之一。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，肝素酶疫苗能通過在活體內誘生出抗肝素酶MAP抗體來有效的減少肝癌組織的MVD（CD34），其作用效果呈一定的濃度依賴性，且與VEGF或bFGF水平存在一定的正相關性：組織或血清中VEGF及bFGF水平越高，MVD數(shù)值也越高，這與其他一些研究者的發(fā)現(xiàn)相似[17]。在本研究中，與血管生成相關的一系列試驗結果表明，肝素酶B細胞疫苗所誘生的特異性抗體可抑制VEGF及bFGF的表達、降低MVD、抑制原發(fā)性肝癌的血管生成，進而可能影響肝癌的生長和轉移。

其次，真實銷售的法律缺位。由于發(fā)起人將應收賬款轉讓給特殊信托機構SPV，信用風險隨之轉移到投資者身上，從而無法保障投資者的權益。因此，該過程必須符合《合同法》的要求。

總之，本研究結果表明，肝素酶B淋巴細胞表位MAP疫苗在活體內能誘生出特異性抗肝素酶MAP多克隆抗體，進而抑制原發(fā)性肝癌的生長及肺轉移，其可能的作用機制為：降低HCC97H肝癌細胞的肝素酶活性及減少腫瘤性血管生成。本研究為肝素酶MAP疫苗臨床用于進展期原發(fā)性肝癌的防治提供了一定的理論依據(jù)。

4　參考文獻

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2]Haro I,Gómara M J.Design of synthetic peptidic constructs for the vaccine development against viral infections[J].Curr Protein Pept Sci,2007,5(6):425-433.

[3]Yang J M,Wang H J,Du L,et al.Screening and identification of novel B cell epitopes in human heparanase and their anti-invasion property for hepatocellular carcinoma[J].Cancer Immunol Immun,2009,58(9):1387-1396.

[4]Simsiriwong P,Eursakun S,Ratanabanangkoon K,et al.A study on the use of caprylic acid and ammonium sulfate in combination for the fractionation of equine antivenom F(ab')(2)[J].Biologicals, 2012,40(5):338-344.

[5]Weidner N.Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer[J].Am J Pathol,1995,47(1):9-19.

[6]Shimizu M,Saitoh Y,Itoh H,et al.Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues[J].Hum Pathol,1990,21(6):607-612.

[7]Zcharia E,Metzger S,Chajek-Shaul T,et al.Molecular properties and involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland morphogenesis[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2001,6:311-322.

[8]Vlodavsky I,Elkin M,Abboud-Jarrous G,et al.Heparanase:one molecule with multiple functions in cancer progression[J].Connect Tissue Res,2008,49(3):207-210.

[9]Miao H Q,Liu H,Navarro E,et al.Development of heparanase inhibitors for anti-cancer therapy[J].Curr Med Chem,2006,13 (18):2101-2111.

[10]Liang X J,Yuan L,Hu J,et al.Phosphomannopentaose sulfate (PI-88)suppresses angiogenesis by down regulating heparanase and vascular endothelial growth factor in an oxygen-induced retinal neovascularization animal model[J].Mol Vis,2012,18:1649-1657.

[11]Dredge K,Hammond E,Handley P,et al.PG545,a dual heparanase and angiogenesis inhibitor,induces potent anti-tumour and anti-metastatic efficacy in preclinical models[J].Br J Cancer,2011,104(4):635-642.

[12]Borsig L,Vlodavsky I,Ishai-Michaeli R,et al.Sulfated hexasaccharides attenuate metastasis by inhibition of P-selectin and heparanase[J].Neoplasia,2011,13(5):445-452.

[13]朱亮,蔡月琴.白毛黑眼兔眼部虹膜Trp1、Trp2基因克隆與分析[J].中國實驗動物學報,2012,20(2):43-48.

[14]Levy-Adam F,Abboud-Jarrous G,Guerrini M,et al.Identification and characterization of heparin/heparan sulfate binding domains of the endoglycosidase heparanase[J].J Biol Chem, 2005,280(21):20457-20466.

[15]Katz M,Lynn M,Solotorovsky M,et al.Serological and Biological Activities of Anti-Haemophilus influenzae Ribosomal Serum[J].Infect Immun,1981,31(3):1125-1131.

[16]Poon R T,Ng I O,Lau C,et al.Serum vascular endothelial growth factor predicts venous invasion in hepatocellular carcinoma:a prospective study[J].Ann Surg,2011,233(2):227-235.

[17]Xu Y Z,Zhu Y,Shen Z J,et al.Significance of heparanase-1 and vascular endothelial growth factor in adrenocortical carcinoma angiogenesis:potential for therapy[J].Endocrine,2011, 40(3):445-451.

（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-07-24）

基金項目：國家自然科學基金（81400682）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生研究計劃（2013KYA014）

作者單位：310014杭州，浙江省人民醫(yī)院消化內科（張駿、楊建民），胃腸病學重點實驗室（王惠菊、崔盈、陶厚權），病理科（趙仲生）；浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心（潘盈盈）

通信作者：楊建民，E-mail:zjhealth@tom.com

Impact of synthesized multiple antigenic polypeptide vaccine based on B-cell epitopes of human heparanase on growth and pulmonary metastasis of human hepatocellular carcinoma in vivo

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of MAP vaccine based on B cell epitopes of heparanase on primary hepatocellular carcinoma and its mechanism.MethodsRabbits were immunized with the freshly synthesized MAP vaccine to obtain specific antibodies.Tumor-bearing murine model of orthotopic implants with human hepatocellular carcinoma HCC-97H cells were established in BALB/c nude mice,and the vaccine-derived polyclonal antibodies were injected in tumor-bearing nude mice.The tumor growth,pulmonary metastasis and the expression of VEGF,bFGF and CD34 in hepatoma tissues were evaluated and analyzed.ResultsAfter active immunity using the B-lymphocyte MAP vaccine of human heparanase,the specific antibodies of high titer were harvested.Both the pulmonary metastatic foci and the orthotopic HCC volumes and the expression of VEGF, bFGF and CD34(MVD)in experimental groups treated with anti-MAP antibodies were much lower than those in negative control group(P＜0.01)or positive control group(P＜0.05)in a certain dose-dependent manner.ConclusionThis study suggests that the synthesized MAP vaccine based on B-cell epitopes of human heparanase is capable of attenuating human HCC growth and metastasis in nude mice.

【Key words】HeparanaseB cell epitopeHepatocellular carcinomaVaccine