氨基酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

田 園，魯華敏，周 波 *，鐘海雁

（1.稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004）

紅曲發(fā)酵歷史悠久，關(guān)于紅曲方面的研究主要集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用上，許多學(xué)者對(duì)紅曲霉菌代謝產(chǎn)物種類及其功能性等方面做了較多研究，其中紅曲色素是研究較多且應(yīng)用廣泛的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]。目前完全確定結(jié)構(gòu)的紅曲色素有十幾種，其中發(fā)現(xiàn)并確定結(jié)構(gòu)的紅曲黃色素有六種，如安卡紅曲黃素（ankaflavin）和紅曲素（monascin）[3]、xanthomonasin A 和xanthomonasin B[3]、monascusones A和monascusones B[4]。紅曲黃色素不僅因其較好的耐熱性和耐酸性而廣受食品生產(chǎn)者和研究者的喜愛(ài)，還具有一定的生物活性，如monascin及其衍生物對(duì)小鼠T細(xì)胞有免疫抑制作用[5]，能減低皮膚癌的出現(xiàn)幾率[6]；ankaflavin通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)的機(jī)制對(duì)癌細(xì)胞株有選擇性細(xì)胞毒性等[7]，但因菌種的缺乏，有關(guān)紅曲黃色素工業(yè)化生產(chǎn)的研究報(bào)道較少[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)物理化學(xué)誘變獲得一株高產(chǎn)黃色素的紅曲霉突變菌株（Monascus ankamutant）[9]，并對(duì)其合成代謝黃色素的特性進(jìn)行了一定的研究，證實(shí)其合成代謝的黃色素是安卡紅曲黃素（ankaflavine）和紅曲素（monascin）[10-13]，這說(shuō)明紅曲霉突變菌株合成代謝紅曲色素和橘霉素的機(jī)理跟其他紅曲霉菌種合成代謝色素和橘霉素的機(jī)理基本一樣。已有相關(guān)研究報(bào)告說(shuō)明氨基酸對(duì)于紅曲紅色素和橘霉素的合成代謝是一個(gè)非常重要的影響因子[14]，且相關(guān)氨基酸在一定程度能與紅曲色素發(fā)生一定的反應(yīng)生成色素衍生物[15]，在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)紅曲色素和橘霉素合成代謝的相關(guān)報(bào)道[4，14，16-18]，來(lái)研究氨基酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響，希望能為紅曲黃色素和橘霉素的合成代謝機(jī)理的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉突變株菌（Monascus ankamutant）：華南理工大學(xué)生化工程研究室選育并保存。

1.1.2 試劑

玉米粉：市售；氨基酸（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純：廣州市化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面種培養(yǎng)基采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g/L，麥芽汁濃度為6 °Bé。

種子培養(yǎng)基：玉米粉30 g/L，硝酸鈉3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化銨15 g/L，可溶性淀粉70 g/L，葡萄糖20 g/L，玉米漿10 g/L，KH2PO45 g/L，初始pH 4.0。

培養(yǎng)基均121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

2802SUV/VIS紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海尤尼科斯科學(xué)儀器有限公司；C25KC型全溫?fù)u床：美國(guó)New Brunswick Scientific公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ER-180A 型電子天平：日本A&D公司；Aglient 1100高效液相色譜：美國(guó)安捷倫科技有限公司；Scientz IID超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份責(zé)任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)和發(fā)酵方法

斜面種在32 ℃培養(yǎng)2～3 d；種子液32 ℃、160 r/min培養(yǎng)2～3 d；搖瓶發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝30 mL培養(yǎng)基，160 r/min、32 ℃培養(yǎng)7 d，所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均三個(gè)平行，計(jì)算平均值。

1.3.2 分析方法[19]

胞外色價(jià)測(cè)定：取一定體積的發(fā)酵液，4 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)定性濾紙過(guò)濾，濾液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)410 nm下測(cè)定其OD410nm值，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞外黃色素色價(jià)；在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定其OD510nm乘以稀釋倍數(shù)即為胞外紅色素色價(jià)，色價(jià)單位用U/mL表示。

胞內(nèi)色價(jià)測(cè)定：離心后的菌體沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇抽提1 h，然后4 000 r/min離心20 min，上清液過(guò)濾，濾液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)定其OD410nm，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)黃色素色價(jià)；測(cè)定其OD510nm值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)紅色素色價(jià)，色價(jià)單位用U/mL表示。

總黃色素色價(jià)的計(jì)算：總黃色素色價(jià)（U/mL）=胞外黃色素色價(jià)＋胞內(nèi)黃色素色價(jià)。

色調(diào)的計(jì)算：色調(diào)=黃色素色價(jià)/紅色素色價(jià)。

細(xì)胞干質(zhì)量（dry cell weight，DCW）的測(cè)定：吸取5 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心20 min，去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌，4 000 r/min離心20 min，去上清液，重復(fù)三次后沉淀于80 ℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定。

橘霉素的檢測(cè)：5 mL 發(fā)酵液用5 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇抽提1 h，通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎后于4 000 r/min離心20 min，離心上清液通過(guò)濾紙過(guò)濾，濾液再用0.45 μm有機(jī)系膜過(guò)濾，吸取濾液20 μL來(lái)進(jìn)行橘霉素色譜檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件：Aglient 1100的高效液相，柱為Eclipse XDB reverse C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫28 ℃，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（λ=254 nm）；流動(dòng)相（用色譜純磷酸調(diào)pH至2.5）為乙腈/水（35∶65），流動(dòng)相流速為1.0 mL/min[20]，進(jìn)樣量20 μL。

以橘霉素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到橘霉素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=27.11x-70.647（R2=0.995 1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖1 甘氨酸含量對(duì)紅曲黃色素色調(diào)(A)及色價(jià)(B)和橘霉素(C)的影響Fig.1 Effect of glycine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由圖1A及圖1B可知，添加適量的甘氨酸有利于黃色素的合成代謝，從色價(jià)考慮，最適甘氨酸添加量為2g/L，此時(shí)發(fā)酵得到的總黃色素色價(jià)增加量分別是沒(méi)添加甘氨酸發(fā)酵時(shí)的69.82%，再增加甘氨酸的添加量時(shí)，黃色素色價(jià)的增加趨勢(shì)出現(xiàn)下降，且黃色素色調(diào)下降很快，這說(shuō)明甘氨酸不僅有利于黃色素的合成代謝，也有利于紅色素的合成代謝。綜合色價(jià)及色調(diào)考慮，甘氨酸添加量1g/L為宜。

由圖1C可知，添加甘氨酸能明顯促進(jìn)橘霉素合成代謝，當(dāng)甘氨酸添加量為6 g/L時(shí)，橘霉素的合成代謝量是對(duì)照組的6.61倍，提高561%，橘霉素生成量為3.37 mg/L。在本實(shí)驗(yàn)中甘氨酸添加使得發(fā)酵液pH上升，橘霉素生成量上升，這說(shuō)明甘氨酸可能參與了橘霉素的合成代謝，或許為橘霉素的合成代謝提供了結(jié)構(gòu)骨架，至于具體原因有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步討究。

2.2 酪氨酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖2 酪氨酸含量對(duì)紅曲黃色素色調(diào)(A)及色價(jià)(B)的影響Fig.2 Effect of tyrosine content on Monascus yellow pigments hue (A) and color value (B)

由圖2可知，添加酪氨酸對(duì)胞內(nèi)黃色素的產(chǎn)量有明顯的提高，但當(dāng)酪氨酸添加量＞4 g/L時(shí)，黃色素產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。對(duì)于胞外黃色素而言，添加酪氨酸對(duì)其影響不明顯。酪氨酸添加量為4 g/L時(shí)，胞內(nèi)和總黃色素色價(jià)都達(dá)到最大，分別比沒(méi)添加酪氨酸時(shí)高出44.10%和42.46%。同時(shí)隨著酪氨酸的添加，黃色素色調(diào)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但都＞2。綜合色價(jià)及色調(diào)，酪氨酸添加量4 g/L為宜。

結(jié)果表明，一定添加量的酪氨酸明顯有利于黃色素的合成代謝且發(fā)酵液黃色素色調(diào)下降較慢，同時(shí)對(duì)橘霉素合成代謝影響不明顯，發(fā)酵液中并沒(méi)有檢測(cè)到橘霉素，相比于甘氨酸而言，酪氨酸更適合于作為培養(yǎng)基中的一種底物來(lái)促進(jìn)黃色素的合成代謝。

2.3 亮氨酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖3 亮氨酸含量對(duì)紅曲黃色素色調(diào)(A)及色價(jià)(B)和橘霉素(C)的影響Fig.3 Effect of leucine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由圖3可知，亮氨酸的添加對(duì)黃色素生成量和色調(diào)的影響不明顯。當(dāng)亮氨酸添加量為3 g/L時(shí)，總黃色素色價(jià)相比于沒(méi)添加亮氨酸發(fā)酵時(shí)只高出5.94%。從色調(diào)和色價(jià)的綜合來(lái)看，亮氨酸對(duì)紅曲色素的合成代謝沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用。綜合色價(jià)及色調(diào)考慮，不添加亮氨酸添為宜。

隨著亮氨酸的添加，橘霉素的合成代謝受到一定的消除影響，如當(dāng)亮氨酸添加量為6 g/L和1 g/L時(shí)，橘霉素生成量分別為0.36 mg/L和0.47 mg/L，分別是不添加亮氨酸發(fā)酵時(shí)橘霉素生成量的70.59%和92.16%，分別下降29.41%和7.84%（見(jiàn)圖3C），但是至于具體影響原因可能是因?yàn)榱涟彼岵焕谕蛔兙甑纳L(zhǎng)而導(dǎo)致橘霉素代謝生成量下降，也可能是亮氨酸影響了相關(guān)酶的活性從而導(dǎo)致橘霉素的合成代謝受到一定的影響。

2.4 天冬氨酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

由圖4可知，添加適量的天冬氨酸是有利于黃色素的合成代謝，當(dāng)天冬氨酸添加量為1 g/L時(shí)，此時(shí)胞外、胞內(nèi)和總黃色素色價(jià)分別高出沒(méi)添加天冬氨酸時(shí)的29.30%、10.019%和12.29%。綜合色價(jià)及色調(diào)考慮，天冬氨酸添加量1 g/L為宜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加適量的天冬氨酸（1 g/L）是較有利于黃色素的合成代謝且發(fā)酵液黃色素色調(diào)也不會(huì)明顯下降，但天冬氨酸對(duì)橘霉素的合成代謝不能起到明顯的消除效果（見(jiàn)圖4C）。當(dāng)天冬氨酸添加量為4 g/L時(shí)，橘霉素生成量最大，為1.02 mg/L是不添加時(shí)的2.43倍。

2.5 其他氨基酸對(duì)紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

在本實(shí)驗(yàn)中還研究了幾種氨基酸（如苯丙氨酸、組氨酸、纈氨酸、脯氨酸和精氨酸）對(duì)黃色素色價(jià)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，相比于沒(méi)添加氨基酸發(fā)酵時(shí)的黃色素色價(jià)而言，隨著各種氨基酸的添加量從1 g/L增加到6 g/L，黃色素色價(jià)減少量都≥20%，有些黃色素減少量甚至達(dá)到83.15%（如苯丙氨酸），結(jié)果都表明這些氨基酸對(duì)黃色素色價(jià)都有不利的影響。

表1 氨基酸對(duì)黃色素色價(jià)的影響Table 1 Effect of amino acid on Monascus yellow pigments color value

氨基酸不利于黃色素的合成代謝很可能是兩個(gè)原因的結(jié)果造成，一是氨基酸對(duì)紅曲霉突變菌株的生長(zhǎng)造成不利從而影響了黃色素量的積累；最主要的原因是氨基酸從代謝途徑上影響了黃色素的合成代謝，抑制了黃色素的合成從而導(dǎo)致黃色素色價(jià)下降。

就橘霉素而言，絕大部分氨基酸對(duì)橘霉素的合成代謝能起到一定的消除效果，結(jié)果見(jiàn)表2。并且隨著氨基酸質(zhì)量濃度的增加，橘霉素的合成代謝受到的抑制作用越明顯，如添加纈氨酸使得橘霉素含量從0.88 mg/L到未檢測(cè)出來(lái)，組氨酸的添加是最明顯能消除橘霉素的合成代謝。

表2 氨基酸對(duì)橘霉素合成代謝的影響Table 2 Effect of amino acid on citrinin production by Monascus anka mutant

3 結(jié)論

不論從基因水平還是酶水平，氨基酸作為氮源對(duì)于紅曲色素的合成代謝的調(diào)控十分復(fù)雜，尤其是有些氨基酸本身參與了色素的合成，如有報(bào)道亮氨酸的存在導(dǎo)致了紅曲紅色素的降解[21]，但是在本研究亮氨酸對(duì)紅曲黃色素的合成代謝影響不明顯，從色調(diào)上也并沒(méi)有體現(xiàn)出亮氨酸對(duì)紅曲紅色素合成代謝有不利的影響。組氨酸、甘氨酸、酪氨酸和精氨酸有利于紅色素的合成，可以通過(guò)副產(chǎn)物蘋(píng)果酸的生成來(lái)解釋，因?yàn)榧t色素的生成跟蘋(píng)果酸的積累有關(guān)[22]。

最近研究報(bào)道在化學(xué)合成培養(yǎng)基條件下，添加不同的氨基酸來(lái)研究其對(duì)紅色素和橘霉素合成代謝的影響，發(fā)現(xiàn)添加甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸和組氨酸有利于Monascus ruberATCC 96218合成代謝紅色素，同時(shí)能明顯抑制橘霉素的合成代謝，谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸能有利于橘霉素的合成代謝。組氨酸不僅能有利紅色素的合成代謝，更能完全消除橘霉素的合成代謝，其歸結(jié)于組氨酸形成的H2O2的功勞[14，23]。對(duì)于其他真菌毒素，如寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和皮殼青霉（Penicillium crustosum）中的赭曲霉素，氨基酸對(duì)其也有同樣的效果[24-26]。在本研究中，除了酪氨酸和甘氨酸明顯有利于黃色素合成代謝外，其余都不利于黃色素的合成代謝或影響不明顯，尤其是組氨酸和精氨酸的添加非常不利于黃色素的合成代謝。半胱氨酸鹽酸鹽、苯丙氨酸、組氨酸、纈氨酸和脯氨酸能明顯消除橘霉素的合成代謝，但是甘氨酸能促進(jìn)橘霉素的合成代謝，其機(jī)理還不清楚，有待進(jìn)一步研究，而其他的氨基酸對(duì)橘霉素的合成代謝影響不是很明顯。本文作者認(rèn)為氨基酸消除橘霉素的合成代謝主要有兩個(gè)原因：一是氨基酸在代謝當(dāng)中產(chǎn)生一些化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致橘霉素的合成代謝受到不利影響，如組氨酸在代謝途徑中產(chǎn)生了過(guò)氧化氫，破壞了橘霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而使得橘霉素含量下降[27]；二是因?yàn)榘被釋?duì)橘霉素的合成代謝途徑有一定的抑制作用。

從工業(yè)化生產(chǎn)黃色素角度考慮，通過(guò)添加4 g/L的酪氨酸不僅有利于Monascus ankamutant合成代謝黃色素，還能降低橘霉素的代謝生成量。

[1]唐秋琳，趙 海，王忠彥，等.一株產(chǎn)黃色素紅曲霉MonascusHB-5 的生物學(xué)特性研究[J].食品科技，2006（7）：47-51.

[2]馬美榮，方慧英，王正祥，等.紅曲霉單產(chǎn)黃色素突變株的選育[J].微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（4）：66-69.

[3]CHEN Y L,HWANG I E,LIN M C,et al.Monascus purpureusmutant and its use in preparing yellow pigment,US:6635467[P].2003-10-25.

[4]CHUL S S,HYUNG J K,MOON J K,et al.Morphological change and enhanced pigment production ofMonascuswhen cocultured withSacch-aromyces cerevisiaeorAspergillus oryzae[J].Biotechnol Bioeng,1998,59(8):576-581.

[5]YONGSMITH B,CHAISRISOOK C,CHIMANAGE P,et al.Papers of the symposium onMonascusculture and application[C].Toulouse France,1998,26(9):115-126.

[6]YONGSMITH B,KRAIRAK S,BAVAVODA R.Production of yellow pigments in submerged culture of a mutant ofMonascussp.[J].Journal of Fermentation Bioengineering,1994,78(3):223-228.

[7]YONGSMITH B,KITPRECHAVANICH V,CHITRADON L,et al.Color mutants ofMonascussp.Kb9 and their comparative glucoamylase on rice solid culture[J].J Mol Catal B:Enzym,2000,10(1-3):263-272.

[8]KRAIRAK S,YAMAMURA K,IRIE R,et al.Maximizing yellow pigment production in fed-batch culture ofMonascussp.[J].J Biosci Bioeng,2000,90(4):363-367.

[9]YONGSMITH B,TABLOKA T,YONGMANITCHAI W,et al.Culture conditions for yellow pigment formation byMonascussp.KBlO grown in cassava medium[J].World J Microbiol Biotechnol,1993,9(1):85-90.

[10]YONGSIMTH B,THONGPRADIS P,KLINSUPA W,et al.Fermentation and quality of yellow pigments from golden brown rice solid culture by a selectedMonascusmutant[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(20):8895-8902.

[11]HAJJAJ H,BLANC P J.Biosynthetic pathway of citrinin in the filamentous，fungusMonascus ruberas revealed by 13C nuelear magnetic resouance[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(1):311-314.

[12]周 波，王菊芳，吳振強(qiáng)，等.高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（12）：1909-1914.

[13]ZHOU B,WANG J F,PU Y W,et al.Optimization of culture medium for yellow pigments production withMonascus ankamutant using response surface methodology[J].Eur Food Res Technol,2009,228(6):895-901.

[14]HAJJAJ H,FRANCOIS J M,GOMA G,et al.Effect of amino acids on red pigments and citrinin production inMonascus ruber[J].J Food Sci,2012,77(3):156-159.

[15]CARELS M,SHEPHERD D.The effect of pH and amino acid on conidiation and pigment production ofMonascus majorATCC 16362 andMonascus rubiginosusATCC 16367 in submerged shaken culture[J].Can J Microbiol,1978,24:1346-1357.

[16]周 波，朱明軍，王菊芳，等.銨鹽對(duì)紅曲黃色素、紅色素及橘霉素代謝形成的影響[J].重慶工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，23（1）：46-53.

[17]周 波，楊 玲，崔思穎，等.響應(yīng)面法提高紅曲黃色素色調(diào)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，36（11）：91-95.

[18]周 波，浦躍武，朱明軍，等.氮源對(duì)紅曲霉突變菌株產(chǎn)黃色素的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（2）：123-127.

[19]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB.4926—2008 食品添加劑紅曲米（粉）[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[20]XU G R,CHEN Y,YU H L.HPLC fluorescence method for determination of citrinin fromMonascuscultures[J].Archiv fur Lebensmittelhygiene,2003,24(4):82-84.

[21]LIN T F,DEMAIN A L.Leucine interference in the production of water-soluble redMonascuspigments[J].Archiv fur Microbiology,1994,162(2):114-119.

[22]HAJJAJ H,BLANC P J,GROUSSAC E,et al.Kinetic analysis of red pigment and citrinin production byMonascus ruberas a function of organic acid accumulation[J].Enzyme Microb Technol,2000,27(8):619-625.

[23]HAJJAJ H,KLAEBE A,GOMA G,et al.Medium chain fatty acids affect citrinin production in the filamentous fungusMonascus rubber[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(3):1120-1125.

[24]DOYLE M P,MARTH E H.Peroxidase activity in mycelia ofAspergillus parasiticusthat degrade aflatoxin[J].Eur J Appl Microbiol,1979,5(7):211-217.

[25]FOULER S,TRIVEDI A B,KITABATAKE N.Detoxification of citrinin and ochratoxin A by hydrogen peroxide[J].J AOAC Int,1994,77(3):631-637.

[26]HATTON P V,KINDERLERER J L.Toxicity of medium chain fatty acids toPenicillium crustosomthom and their detoxification to methyl ketones[J].J Appl Bacteriol,1991,70(3):401-407.

[27]HAJJAJ H,GOMS G E,et al.Improvement of red pigmet/citrinin production ratio as a function of environmental conditions byMonascus rubber[J].Biotechnol Bioeng,1999,64(4):497-501.