Survivin、HPV16—E7蛋白、VEGF在宮頸鱗癌及癌前病變中的表達(dá)及臨床意義

湯艷

[摘要] 目的 探討Survivin、HPV16-E7蛋白、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織中的表達(dá)及在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 采用免疫組化SP法檢測50例宮頸鱗癌、90例宮頸上皮內(nèi)瘤變（其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各為30例）中Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF的表達(dá)，另取正常宮頸者20例為對(duì)照組。結(jié)果Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ、CINⅢ）中的表達(dá)均隨宮頸病變而呈遞增趨勢（P<0.05）；Survivin的高表達(dá)與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；VEGF的高表達(dá)與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；HPV16-E7蛋白的高表達(dá)與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05）。Survivin與HPV16-E7蛋白和VEGF的表達(dá)間存在正相關(guān)（r=0.417， P<0.01；r=0.378， P<0.01）。結(jié)論Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸鱗癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；Survivin；HPV16-E7；VEGF

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）08-0101-03

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和病死率在女性惡性腫瘤中居第二位[1]。腫瘤的發(fā)生、演變、惡化是多基因、多因素、多階段的過程，其浸潤和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。研究表明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是由于致癌因子通過不同機(jī)制致使原癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞增殖及凋亡失調(diào)所致[2]。而高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的感染在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[3]。Survivin是一種凋亡抑制基因，該基因表達(dá)的Survivin蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分子量最小也是抗凋亡作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP）。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增生、遷移和浸潤的作用。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測Survivin、HPV16-E7蛋白、VEGF 在宮頸鱗癌（squamors cell carcinoma of cervical，SCC）及癌前病變組織中的表達(dá)，探討三者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集本院2002～2012年手術(shù)切除的140例患者石蠟包埋標(biāo)本，常規(guī)取材，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，且確診前未接受任何治療?；颊吣挲g22～56歲，中位年齡41歲。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各30例。宮頸鱗癌50例：按 FIGO分期（2009年）：Ⅰb期20例、Ⅱa期30例）；按組織分化程度： 高分化22例， 中分化 12例， 低分化 16例；按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者19例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者31例。另取同期因子宮肌瘤、子宮腺肌瘤行全子宮切除術(shù)并且術(shù)后病理證實(shí)為正常宮頸者20例作為對(duì)照組。

1.2 方法

采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。濃縮型兔抗人Survivin多克隆抗體為Neomarker公司產(chǎn)品，鼠抗人HPV16 -E7單克隆抗體為美國 Santa Cruz公司產(chǎn)品，鼠抗人VEGF單克隆抗體、SP試劑盒等均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所有標(biāo)本經(jīng)10 %多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚的連續(xù)切片，根據(jù)試劑要求進(jìn)行抗原熱修復(fù)處理后，采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，免疫標(biāo)記操作及程序見試劑說明書。取已知有該蛋白表達(dá)的切片為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色為Survivin 和VEGF 陽性標(biāo)記。高倍鏡下選取 10 個(gè)/ HPE， 每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100 個(gè)細(xì)胞， 以每例陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為+， 51%～75%為+ +，≥76%為+ + +。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色著色為HPV16- E7陽性標(biāo)記，連續(xù)觀察 10個(gè)高倍視野，以陽性細(xì)胞數(shù) > 10%為陽性[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析Survivin與HPV16- E7蛋白及Survivin與VEGF的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF在宮頸組織中的表達(dá)

Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、宮頸鱗癌中的表達(dá)均隨宮頸病變加重而呈遞增趨勢。Survivin在CINⅡ組與CINⅠ組、CINⅢ組與CINⅡ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.320，P<0.05； χ2=4.444，P<0.05）、HPV16-E7蛋白CINⅡ組與CINⅠ組、CINⅢ組與CINⅡ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.079，P<0.05； χ2=4.344，P<0.05）；VEGF在CINⅡ組與CINⅠ組、CINⅢ組與CINⅡ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.812，P<0.05； χ2=4.286， P<0.05）；Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在SCC組與CINⅢ組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.391，P<0.05； χ2=3.988，P<0.05； χ2=4.688，P<0.05），見表1。

2.2宮頸鱗癌中Survivin、HPV16- E7蛋白和VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系endprint

HPV16- E7蛋白表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05）。Survivin的表達(dá)在中低分化者中陽性率高于高分化者（χ2=6.158，P<0.05）；Ⅱa期的陽性表達(dá)率高于Ⅰb期（χ2=4.678，P<0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者（χ2=5.898，P<0.05）。VEGF的表達(dá)在中低分化者中陽性率高于高分化者（χ2=5.082，P<0.05）；Ⅱa期的陽性表達(dá)率高于Ⅰb期（χ2=6.527，P<0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者（χ2=6.727，P<0.01），見表2。

2.3 各組中Survivin的表達(dá)與HPV16-E7蛋白、VEGF表達(dá)的關(guān)系

本組資料中，在CINⅡ、CINⅢ及宮頸鱗癌組中Survivin與HPV16- E7蛋白的陽性表達(dá)間存在正相關(guān)（r=0.417，χ2=19.125，P<0.01）；Survivin與VEGF的陽性表達(dá)間存在正相關(guān)（r=0.378， χ2=15.707，P<0.01），見表3。

3 討論

在宮頸非典型增生向?qū)m頸癌演變過程中，病毒整合是一重要機(jī)制。病毒的整合導(dǎo)致了病毒基因表達(dá)失調(diào)、宿主基因不穩(wěn)定，甚至導(dǎo)致了細(xì)胞癌基因的激活，決定了細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[5]。大量流行病學(xué)和生物學(xué)資料顯示，高危型HPV感染是誘發(fā)宮頸癌的重要原因。HPV的致病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前認(rèn)為主要是由于HPV的E6和E7癌蛋白分別與其宿主細(xì)胞的p53和pRB蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致了p53和pRB蛋白降解和滅活，進(jìn)而使上皮細(xì)胞退出分化程序，持續(xù)增生而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[6]。而HPV16與宮頸鱗癌關(guān)系最為密切[7]。本研究表明，在宮頸鱗癌中HPV陽性率明顯高于CIN和正常宮頸組，CINⅡ組及CINⅢ組亦高于對(duì)照組，其與宮頸癌臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明HPV感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。因此，預(yù)防HPV感染對(duì)防止宮頸癌的發(fā)生具有重要意義。

Survivin 基因是近年來分離的凋亡抑制蛋白IPA基因家族的新成員。Survivin 的作用靶點(diǎn)位于凋亡途徑的下游匯集點(diǎn)，通過死亡受體途徑和線粒體途徑，最終作用于Caspase-3和Caspase-7起到抗凋亡作用[8]。Survivin基因只在胚胎中表達(dá)，在成人已分化組織中不表達(dá)或低表達(dá)，但在人體內(nèi)的幾乎所有惡性腫瘤中都有明顯表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)表明，Survivin在正常宮頸中低表達(dá)，在宮頸癌及其癌前病變中的表達(dá)隨病情進(jìn)展有逐漸增高趨勢。CINⅡ組、CINⅢ組、SCC組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而CINⅡ組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示在宮頸癌病變過程中的早期已有凋亡調(diào)節(jié)的參與。此結(jié)果與張璇等[10]的研究結(jié)果一致。

腫瘤血管生成在腫瘤組織的生長、轉(zhuǎn)移中起著重要作用。VEGF是腫瘤血管生成過程中特異性最強(qiáng)的促血管生長因子，其在很多人類的腫瘤細(xì)胞中存在高水平的表達(dá)，且在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[11]。其與多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究顯示，從正常宮頸到CIN，再到宮頸癌，VEGF表達(dá)水平呈進(jìn)行性升高，該結(jié)果與Dai[12]等結(jié)果相符。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達(dá)和HPV16-E7蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0417，P<0.05）。這與王江莉等[13]的研究一致。由此推測，HPV16可能直接或間接調(diào)節(jié)了Survivin蛋白的表達(dá)及細(xì)胞分布，兩者對(duì)宮頸癌的發(fā)生可能起著協(xié)同作用。近年來研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的VEGF能誘導(dǎo)和促進(jìn) Survivin 的高表達(dá)，而 Survivin 的表達(dá)上調(diào)又是內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過程中維持生存活力的必要條件[14，15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，宮頸癌及癌前組織中，Survivin的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.378，P<0.05）。Survivin表達(dá)上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移，二者在促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著協(xié)同作用。

綜上所述，宮頸癌中Survivin、HPV16-E7蛋白、VEGF基因表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。對(duì)三者進(jìn)行檢測，或許成為對(duì)宮頸癌患者的預(yù)后判定的重要指標(biāo)[16]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sankaranarayanan R，F(xiàn)erlay J. Worldwide burden of gynecological cancer：the size of the problem[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2006，20（2）：207-225.

[2] 糜若然，瞿全新. 婦科腫瘤基因診斷與治療[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：8，38.

[3] Huang LW，Chao SL，Chen PH，et al. Multiple HPV genotypes in cervical carcinomas improved DNA detection and typing in archival tissues[J]. J Clin Virol，2004，29（4）：271-276.

[4] Frost M，Jarboe A，Orlicky D，et al. Immunohi st ochemical loca-lization of survivin in benign cervical mucosa，cervical dysplesia，and invasive squamous cell carcinoma[J]. Am Clin Pathol，2002，117（5）：738-744.

[5] Furumoto H，Irahara M. Human papillomavirus （HPV） and cervical cancer[J]. Jmed Invest， 2002，49（3-4）：124-133.endprint

[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏榮耀，張冉冉， 孫亞嬌，等. SURVIVIN基因與腫瘤相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 張璇，何愛琴，季月紅. Survivin與高危型HPV的相關(guān)性及其在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌診斷預(yù)測中的意義[J]. 疑難病雜志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王曉麗，何躍東，黃娟. eIF4E和VEGF 在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陳素琴，張君娜，等. Survivin及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與人乳頭瘤病毒在宮頸病變中表達(dá)的相關(guān)性[J]. 中國腫瘤臨床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 魯靜，李海燕，李曉紅，等. Survivin、MMP-9在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陳玉梅，金黎，陳惠琴. 不同宮頸錐切方法治療宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)的臨床療效評(píng)價(jià)[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（19）：106-108.

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[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏榮耀，張冉冉， 孫亞嬌，等. SURVIVIN基因與腫瘤相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 張璇，何愛琴，季月紅. Survivin與高危型HPV的相關(guān)性及其在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌診斷預(yù)測中的意義[J]. 疑難病雜志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王曉麗，何躍東，黃娟. eIF4E和VEGF 在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陳素琴，張君娜，等. Survivin及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與人乳頭瘤病毒在宮頸病變中表達(dá)的相關(guān)性[J]. 中國腫瘤臨床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 魯靜，李海燕，李曉紅，等. Survivin、MMP-9在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陳玉梅，金黎，陳惠琴. 不同宮頸錐切方法治療宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)的臨床療效評(píng)價(jià)[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（19）：106-108.

（收稿日期：2013-12-19）endprint

[6] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. Clin Sci（Lond），2006，110（5）：525-541.

[7] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human Papillomaviru s（HPV） type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice[J]. J Natl Cancer In St，2005，97（14）：1072 -1079.

[8] 夏榮耀，張冉冉， 孫亞嬌，等. SURVIVIN基因與腫瘤相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（3）：662-665.

[9] Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B，et al. Antibody response to the tumor associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J]. Cancer Res，2000，60 （7）：1815-1817.

[10] 張璇，何愛琴，季月紅. Survivin與高危型HPV的相關(guān)性及其在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌診斷預(yù)測中的意義[J]. 疑難病雜志，2011，10（2）：91-93.

[11] 王曉麗，何躍東，黃娟. eIF4E和VEGF 在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，41（1）：179-181.

[12] Dai Y，Zhang X，Peng Y，et al. The expression of cyclooxygenase- 2，VEGF and PGs in CIN and cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2005，97（1）：96 -103.

[13] 王江莉，陳素琴，張君娜，等. Survivin及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與人乳頭瘤病毒在宮頸病變中表達(dá)的相關(guān)性[J]. 中國腫瘤臨床，2007，34（6）：909-916.

[14] Tran J，Rak J，Sheehan C，et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，264（3）：781-788.

[15] 魯靜，李海燕，李曉紅，等. Survivin、MMP-9在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（14）：26-27.

[16] 陳玉梅，金黎，陳惠琴. 不同宮頸錐切方法治療宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)的臨床療效評(píng)價(jià)[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（19）：106-108.

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